关于免疫调节剂对1型糖尿病大鼠Foxp3表达的影响

【摘要】 目的 探讨Foxp3在1型糖尿病大鼠模型中的表达和意义及其在来氟米特、百灵胶囊、雷公藤治疗机制中的作用。方法 将50只大鼠随机分为5组，每组各10只，Ⅰ～Ⅳ组采用小剂量多次注射链脲佐菌素（STZ）制备大鼠1型糖尿病模型，Ⅴ组为正常对照组。成模后分别给予来氟米特（Ⅰ组）、雷公藤（Ⅱ组）、百灵胶囊（Ⅲ组）灌胃，每天1次，连续2个月，Ⅳ组为非用药糖尿病对照组。荧光定量PCR检测外周血单个核细胞及脾淋巴细胞Foxp3 mRNA 的表达，免疫组化检测淋巴结和脾组织Foxp3蛋白的表达。结果 成模后及给药后Ⅰ～Ⅳ组血糖水平均明显高于Ⅴ组（F=331.894、359.638，P&<0.01）；给药后，Ⅰ～Ⅲ组胰岛中淋巴细胞浸润程度较Ⅳ组减轻；Foxp3 mRNA、Foxp3蛋白表达水平Ⅰ～Ⅳ组均高于Ⅴ组（F=5.895、11.489，P&<0.05）;与Ⅳ组相比，Ⅱ组血中的Foxp3 mRNA升高不明显，脾中显著升高（P=0.028）。结论 Foxp3表达的变化可能参与了STZ诱导的1型糖尿病的发生发展；来氟米特、百灵胶囊、雷公藤对1型糖尿病有一定的治疗作用，上调Foxp3基因的表达有可能为雷公藤治疗机制之一，而来氟米特和百灵胶囊未发现该作用。
【关键词】 免疫调节剂;T淋巴细胞，调节性;叉头蛋白3; 糖尿病，1型
　　［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the expressions and significance of Foxp3 in type 1 diabetic rat model and its effects on therapy using leiflunomide (LEF， group 1)， Tripterygium wilfordii (TW， group 2)， and Bai Ling Capsules (group 3) in treating type 1 diabetes.MethodsFifty rats were evenly pided into five groups. Diabetic models were made by multiple injections of lowdose streptozotocin (STZ) in groups 1-4， and group 5 served as normal control. LEF was then given to group 1， TW to group 2， and Bai Ling to group 3， once a day through intragastric administration， for two months. Group 4 was nonmedication diabetes control group. The expressions of Foxp3 mRNA in peripheral blood and spleen were measured by realtime PCR， and FOXP3 protein in lymphoid node and spleen by immunohistochemistry.ResultsAfter model completed and medication， the blood glucose levels in groups 1-4 were significantly higher than that in group 5 (F= 331.894， 359.638;P&<0.01). Lymphocyte infiltration in pancreatic islet was decreased in groups 1， 2 and 3 compared with that of group 4 after treatment. The expressions of Foxp3 mRNA and protein were increased significantly in groups 1-4 compared with that in group 5 (F=5.895，11.489;P&<0.05). In group 2， however， the increase of Foxp3 mRNA in blood was not significant while that in spleen was significantly higher than that in group 4 (P=0.028).ConclusionThe expressions of Foxp3 are involved in the pathogenesis of type 1 diabetes induced by STZ. LF， TW and Bai Ling have therapeutic effect on type 1 diabetes. Upregulation of Foxp3 expression may be one of the therapic mechanisms of TW， and that effect of LF and Bai Ling has not been observed.
　　［KEY WORDS］Immunoregulants; TLymphocytes， regulatory; Foxp3; Diabetes mellitus， type 1
　　1型糖尿病是一种T细胞介导的胰岛β细胞进行性损伤的自身免疫病。目前认为CD4+ CD25+调节性T细胞（Tr）是机体免疫系统外周耐受维持的一个重要的调控者，其正常的水平和功能将有助于免疫系统对自身抗原的刺激建立良好的耐受状态，从而抑制自身免疫病的发生[1]。转录因子Foxp3特异地高表达于Tr细胞，与其发育和功能成熟密切相关[2]。
　　目前对1型糖尿病进行免疫干预研究已经取得了显著的进展。雷公藤多甙具有较强的免疫抑制和调节作用；百灵胶囊是一种免疫调节剂，具有刺激免疫器官淋巴组织增生、调节细胞因子活性等作用；来氟米特为一种新型免疫抑制剂。这些药物的作用机制是否与Tr细胞的活性有关，国内外尚无相关报道。本实验通过构建1型糖尿病大鼠模型，经上述免疫调节剂治疗后观察大鼠外周血及脾脏单个核细胞Foxp3 mRNA的表达、大鼠淋巴结及脾组织Foxp3蛋白的表达，以期探讨Tr细胞在1型糖尿病发病机制中的作用及其与免疫调节剂的关系，并为临床治疗提供新的思路。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　清洁级Wistar雄性大鼠50只，体质量180～220 g，由青岛市药检所提供。链脲佐菌素（STZ，Sigma 公司），Trizol （Ivitrogen 公司），淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），PrimeScript RTPCR 试剂盒（TaKaRa Code：DRR061S），Foxp3单抗（eBioscence），二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），来氟米特片（苏州长征欣凯制药有限公司），百灵胶囊（北京益众康医药科技有限责任公司），雷公藤多甙（湖南株州制药三厂），微量血糖测定仪（美国强生稳豪），尿糖试纸（长春迪瑞实业有限公司），荧光定量PCR仪（美国ABI 7500）。引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
　　1.2 方法
　　1.2.1 实验分组及糖尿病大鼠模型的建立
　　将50只Wistar大鼠随机分为5组，每组各10只， 1周内饮食正常、体质量不减轻，血糖、尿糖含量正常者即可用于实验。福氏佐剂（CFA）按4∶1称取液体石蜡和羊毛脂，研碎混匀后分装，高压消毒后低温保存，使用前按3 g/L加入无菌灭活卡介苗，进行无菌乳化后使用。将STZ 用0.1 mol/L无菌枸橼酸钠缓冲液新鲜配制成20 g/L溶液，调pH至4.5，滤菌器过滤除菌备用。各组大鼠每只均腹腔注射CFA 0.5 mL。注射CFA 后第2 天，Ⅰ～Ⅳ组大鼠腹腔注射STZ溶液25 mg/kg，对照组（Ⅴ组）大鼠腹腔注射等体积0.1 mol/L的枸橼酸钠溶液。每周1次，连续3周重复上述步骤。每次注射STZ后均测定血糖和尿糖浓度，成模标准

参考文献

[3]。成模后Ⅰ组以来氟米特7.5 mg/（kg·d）、Ⅱ组以雷公藤15 mg/（kg·d）、 Ⅲ组以百灵胶囊0.75 g/（kg·d）灌胃，Ⅳ组（非用药糖尿病组）和Ⅴ组给予生理盐水灌胃，连续2月后处死检测。
　　1.2.2 大鼠胰腺病理变化的观察
　　麻醉后取胰腺，40 g/L多聚甲醛固定后，依次进行系列梯度脱水、浸蜡、包埋及切片，常规苏木精伊红（HE）染色，于光镜下观察结果。
　　1.2.3 荧光定量PCR检测Foxp3 mRNA的表达水合氯醛麻醉大鼠，心内取血5 mL，EDTA抗凝。无菌取脾（剪成两块，一块制成脾细胞悬液，一块行石蜡包埋）。密度梯度离心法分离外周血及脾单个核细胞，利用Trizol 一步法提取总RNA，取总RNA1 μg 进行逆转录反应合成cDNA，采用两步法进行PCR扩增，终体积20 μL。Foxp3上游引物P1：5′GCTGGAGCTGGAAAAGGAGAA3′，下游引物P2：5′GCAGGAGCTCTTGTCCACTGA3′，Taqman探针P3：5′FAMCCACCTGGCTGGGAAGATGGCATTTAMRA3′，产物为106 bp。GAPDH上游引物P4：5′TGGTCTACATGTTCCAGTATGACT3′，下游引物P5：5′CCATTTGATGTTAGCGGGATCTC3′，Taqman 探针P6：5′FAM CCACGGCAAGTTCAACGGCACAGTTAMRA3′，产物为134 bp。PCR反应条件：95 ℃、10 s，95 ℃、5 s，60 ℃、45 s，40个循环。每个样本均做3复孔，取平均值，Foxp3和GAPDH分别在两个管中同时进行反应，结果经内参均一化处理后，以对照组任一例目的基因表达量为参照因子，采用2△△CT法进行分析。
　　1.2.4 免疫组化检测FOXP3蛋白
　　将石蜡包埋的淋巴结、脾组织切成4 μm厚的切片，脱蜡至水，经消除内源性过氧化物酶及抗原复性处理后，进行免疫组化染色，染色参照免疫组化二步法试剂盒说明书操作，苏木精复染后封片。
　　1.3 统计学处理
　　采用SPSS 11.5统计软件。结果以±s表示，组间比较采用F检验及LSD检验。
　　2 结果
　　2.1 大鼠成模率和血糖的检测
　　Ⅰ组于第1周、Ⅲ组于第2周各死亡1只，各有1只未成模，共成模8只；Ⅱ组有8只成模，Ⅳ组分别于注射STZ后1周、2周各死亡1只，1只未成模，成模7只；总成模率 86.11%。成模后及给药后Ⅰ～Ⅳ组血糖水平均较成模前及Ⅴ组显著升高（F=331.894～359.638，P&<0.01），尿糖～，此后一直维持在高水平状态。Ⅰ～Ⅲ组给药后血糖水平较给药前及同期Ⅳ组有所降低，但差异无显著性（P&>0.05）；Ⅰ～Ⅲ组组间比较无显著性差异（P&>0.05）。见表1。表1 大鼠成模前后血糖水平（略）
　　2.2 大鼠胰腺病理变化的观察
　　HE染色结果显示，Ⅰ～Ⅳ组大鼠的胰岛变小，胰岛细胞核肿胀、崩解，间质黏液变性，胰岛细胞数减少，纤维组织增生，发生玻璃样变，胰腺间质及胰岛中可见以淋巴细胞和单核细胞为主体的炎细胞浸润；Ⅰ～Ⅲ组炎细胞浸润程度较Ⅳ组减轻，Ⅰ、Ⅱ组减轻尤为明显。Ⅳ组胰岛除炎细胞大量浸润外，尚可见β细胞明显空泡变性、坏死、消失，使胰岛呈空虚状态。
　　2.3 外周血和脾脏Foxp3 mRNA的表达
　　Ⅰ～Ⅴ组外周血单个核细胞中Foxp3 mRNA表达水平分别为：1.30±0.11，1.34±0.10，1.26±0.18，1.20±0.15，1.03±0.11，Ⅰ～Ⅳ组表达量较Ⅴ组增加（F=5.895，P&<0.05），Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组表达量较Ⅳ组略高，但差异无统计学意义（P&>0.05）。脾淋巴细胞中Foxp3 mRNA水平Ⅰ～Ⅴ组分别为：1.31±0.05，1.35±0.06，1.29±0.07，1.26±0.08，1.11±0.10，Ⅰ～Ⅳ组均较Ⅴ组显著增加（F=11.489，P&<0.01）， Ⅱ组较Ⅳ组表达量升高（P=0.028），Ⅰ、Ⅲ组较Ⅳ组表达量略增加，但差别无显著性（P&>0.05）。

　　2.4 免疫组化染色检查
　　Foxp3蛋白主要定位于细胞核。淋巴结染色结果：阳性细胞弥散分布于淋巴结深皮质区。脾组织染色结果：阳性细胞主要集中于动脉周围淋巴鞘附近，白髓与红髓交界的边缘区也有散在分布。Ⅰ～Ⅳ组淋巴结与脾中阳性细胞数较Ⅴ组显著增加，其中，Ⅰ～Ⅳ组之间无明显差异，Ⅱ组表达量则较各组略有升高。
　　3 讨论
　　研究结果显示，1型糖尿病病人和NOD鼠体内Tr细胞减少，使机体不足以维持自身免疫耐受，T细胞选择性地破坏胰岛β细胞，是其发病的重要因素。而Foxp3是Tr细胞发育和功能的重要调节物质[4]，自身免疫性糖尿病的发生与Foxp3表达的关系目前尚不清楚。
　　本研究采用STZ和CFA联合注射制备大鼠1型糖尿病模型[5]，其造模的机制为：注射CFA 后激活大鼠体内T淋巴细胞，注射小剂量STZ 后诱导胰岛β细胞发生轻度改变，经过3周的不断强化，最终诱发T淋巴细胞对β细胞的攻击，导致1型糖尿病的发生。本研究结果表明，成模后Ⅰ～Ⅳ组糖尿病鼠淋巴细胞Foxp3表达量较正常组增加，这是因为机体免疫系统内环境稳态的维持依赖于Tr细胞和反应性T细胞的动态平衡[6]，在造模过程中，随着T淋巴细胞不断地被激活，Tr细胞的活性也相应上调，表现为Foxp3表达的增强。但终因自身免疫的不断强化，Tr细胞的相对不足，导致平衡失调，表现为糖尿病进一步向纵深发展。

　　研究证实，雷公藤对体液免疫和细胞免疫均有调节作用，还可活化抑制性T细胞，从多个环节抑制免疫应答过程[7，8]。来氟米特、百灵胶囊做为免疫调节剂目前也正广泛应用于1型糖尿病病人的临床治疗中。本实验胰腺HE染色结果表明，用药组炎性细胞浸润程度均较糖尿病对照组减轻。其中，雷公藤和来氟米特组的作用显著，且各用药组2个月后血糖水平均较糖尿病对照组降低，但差别无显著性，说明各组药物虽然在一定程度上能改善胰岛病变的表现，但并不能在很大程度上逆转T淋巴细胞对胰岛β细胞的损害及由此引起的胰岛素水平的绝对不足。
　　本文免疫组化实验结果显示，Ⅰ、Ⅲ组脾和淋巴结Foxp3蛋白表达量较Ⅳ组略有增加，Ⅱ组增加显著，这和荧光定量检测结果相一致。来氟米特和百灵胶囊组外周血和脾淋巴细胞中Foxp3 mRNA表达较糖尿病对照组略有升高，但差异无显著性。提示该药物在对免疫系统功能紊乱调节的同时，对Foxp3的表达无明显影响，推测其对自身免疫的抑制可能是通过其他途径，如提高Th3或Tr1的活性，改变淋巴细胞因子分泌状态等实现的，具体机制尚待进一步的研究。雷公藤组外周血单个核细胞中Foxp3 mRNA水平与糖尿病对照组相比无显著性差异，但脾淋巴细胞中Foxp3表达水平升高，这可能与脾淋巴细胞中Tr细胞含量较高有关，结合雷公藤组Foxp3蛋白表达量的显著增加，提示雷公藤可能通过上调Foxp3的表达来调节Tr细胞活性，从而实现其对1型糖尿病的治疗作用。
【

参考文献

】
　　[1]HOMANNA D， HERRATH M G. Regulatory T cells and type 1 diabetes[J]. Clin Immunol， 2004，112(3):202209.

　　[2]HORI S， SAKAGUCHI S. Foxp3: a critical regulator of the development and function ofregulatory T cells[J]. Microbes Infection， 2004，6(8):745751.

　　[3]耿娅，纪丽曼，周兴军，等. 链脲佐菌素致迟发型大鼠1型糖尿病模型的研究[J]. 河北医药， 2006，28(10):906907.

　　[4]FONTENOT J D， GAVIN M A， RUDENSKY A Y， et al. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells[J]. Nat Immunol， 2003，4(4):330336.

　　[5]ZIEGER M， ZIEGLER B， HEHMKE B， et al. Autoimmune response directed to pancreatic beta cells in rats induced by combined treatment with low dose of streptozotocin and complete freund’s adjuvant[J]. Biomed Biochim Act， 1984，43(5):675681.

　　[6]HELENE B J， BENOIT L S， HEATHER L T， et al. Costimulation controls diabetes by altering the balance of pathogenic and regulatory T cells[J]. Clin Invest， 2004，114(7):979987.

　　[7]秦风华，谢蜀生，龙振洲. 雷公藤总甙免疫抑制作用的机制[J]. 中国药理学报， 1991，7(6):433436.

　　[8]孟庆军，吴敏. 双嘧达莫与雷公藤多甙联合治疗过敏性紫癜48例临床分析[J]. 齐鲁医学杂志， 2002，17(2):164165.