关于染料木素促乳癌细胞增生和IGF1R mRNA 表达机制

【摘要】 目的 研究染料木素促人乳癌（MCF7）细胞增生及IGF1R mRNA 表达机制。方法 MCF7细胞常规培养后，用ICI182，780或JB1与染料木素共同培养，以阻断雌激素受体（ER）或IGF1R。MTT法观察细胞生长情况，RTPCR技术观察IGF1R基因表达情况。结果 染料木素对MCF7细胞具有增生效应，与对照组相比差异有统计学意义(F=14.627，q=3.76，P&<0.05)，此效应可以被ER拮抗剂ICI182，780或IGF1R拮抗剂JB1完全阻断(q=3.89、4.25，P&<0.05)；染料木素可增加IGF1R基因表达(F=21.695，q=4.94，P&<0.01），此效应也能够被ICI182，780或JB1完全阻断(q=5.03、5.89，P&<0.01）。结论 染料木素可以促进MCF7细胞的增生和IGF1R mRNA的表达，此作用可以被ER 拮抗剂ICI182，780或IGF1R拮抗剂JB1完全阻断。
【关键词】 染料木素；受体，IGF1型；受体，雌激素；乳腺肿瘤
　　［ABSTRACT］ObjectiveTo study the mechanism of stimulating effects of genistein on breast cancer cell proliferation and IGF1R mRNA expression. MethodsMCF7 cells were cultured in genistein with or without ICI182， 780 and JB1， respectively. ICI182，780 was used to block the estrogen receptor (ER) and JB1 to block the insulinlike growth factor 1 receptor (IGF1R).The cell proliferation was observed via MTT method. The IGF1R mRNA expression was detected by RTPCR.ResultsGenistein stimulated the growth of MCF7 cells (F=14.627，q=3.76，P&<0.05)， which could be completely blocked by ER antagonist ICI182，780 or IGF1R antagonist JB1 (q=3.89，4.25;P&<0.05). Genistein increased the IGF1R gene expression (F=21.695，q=4.94，P&<0.01) and this effect could also be entirely blocked by ICI182，780 or JB1 (q=5.03，5.89;P&<0.01).ConclusionGenistein can stimulate MCF7 cell proliferation and IGF1R gene expression， which can be totally blocked by ER antagonist ICI182，780 and IGF1R antagonist JB1.
　　［KEY WORDS］Genistein; Receptor， IGF type 1; Receptors， estrogen; Breast neoplasms
　　染料木素是大豆异黄酮的主要活性成分，其化学结构和雌激素相似，是已知的植物雌激素。研究显示，染料木素可以与雌激素受体(ER)结合，发挥其类雌激素样作用[1]，其类雌激素样作用有助于改善绝经期妇女潮热、抑郁和阴道炎等症状，由于雌激素在调节骨的内稳态以及防止绝经后骨量丢失方面发挥重要作用[2]，因此，染料木素对骨质疏松的发生也有预防作用。生理剂量的染料木素能够促进ER阳性的人乳癌(MCF7)细胞增生[3]。有研究表明，染料木素对MCF7细胞的促进作用是通过其类雌激素样的作用机制实现的。染料木素通过与ER结合，激活一系列与细胞增生相关的雌激素反应基因[4]，从而促进ER阳性的MCF7细胞的增生。近期研究显示，在ER阳性的MCF7细胞中，ER途径和IGF1R途径存在着交互作用[5]。染料木素是否也可以通过ER信号转导途径与IGF1信号转导途径的交互作用，发挥其对ER阳性的MCF7细胞的增生效应，目前未见报道。因此，本研究应用ER阳性的乳癌细胞MCF7模型系统，探讨染料木素对MCF7细胞增生和IGF1R mRNA表达的调控机制，以期为染料木素的类雌激素样作用机制提供进一步的实验依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 试剂及其来源
　　MCF7 细胞购自美国ATCC公司。DMEM 培养基购自美国Invitrogen公司。Genistein购自美国Sigma公司。ICI182，780购自英国Tocris公司。
　　JB1购自瑞士Bachem公司。逆转录聚合酶链反应试剂盒购自美国Promega公司。Tag DNA聚合酶购自日本TAKARA公司。
　　1.2 MCF7细胞的培养
　　MCF7细胞接种于96孔板或6孔板，用含体积分数0.05胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃含体积分数0.05 CO2的培养箱中培养。细胞汇合达70％时，使用含10 g/L活性炭处理的胎牛血清(sFBS)的无酚红DMEM继续培养72 h。分别用染料木素(1 μmol/L)、ICI182，780 (1 μmol/L)或JB1 (1 mg/L)处理48 h，分为对照组、染料木素组、染料木素+ICI182，780组、染料木素+JB1组。
　　1.3 MTT法检测细胞生长
　　MCF7细胞接种于96孔板中，每孔细胞数量为3×103个。用含体积分数0.01 sFBS的无酚红DMEM培养72 h，在有或无ICI182，780和JB1共存的情况下，用染料木素(1 μmol/L)处理细胞，48 h后去除培养液，加入20 μL的MTT(5 g/L)，置于37 ℃含体积分数 0.05 CO2培养箱继续培养4 h，每孔加DMSO 100 μL，混匀后用酶标仪检测492 nm处的吸光度，计算细胞生长率。
　　1.4 逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测IGF1R mRNA的表达
　　
　　应用Trizol法从细胞中提取总RNA，取2 μg总RNA进行RTPCR扩增。IGF1R上游引物：5′ACTATGCCGGTGTCTGTGTG3′，下游引物：5′ TGCAAGTTCTGGTTGTCGAG3′，扩增产物长为522 bp；GAPDH上游引物：5′ACCACAGTCCATGCCTACAC3′，GAPDH下游引物：5′TTCACCACCCTGTTGCTGT3′，扩增产物长为422 bp。将PCR产物在20 g/L的琼脂糖凝胶上进行电脉，应用天能凝胶成像分析软件对条带进行半定量分析，检测IGF1R mRNA与其对应的内参照GAPDH mRNA RTPCR产物的灰度值，用二者PCR产物条带的灰度值比值表示IGF1R mRNA表达水平。
　　2 结 果
　　2.1 染料木素对MCF7细胞的增生效应及ICI182，780和JB1对其的阻断效应
　　药物作用48 h后，酶标仪检测结果显示，对照组吸光度值为0.914±0.113，染料木素组为1.174±0.089，两组比较，差别有统计学意义（F=14.627，q=3.76，P&<0.05）；染料木素+ICI182，780组吸光度值为0.723±0.148，与染料木素组相比，差别有统计学意义(q=3.89，P&<0.01），染料木素+JB1组吸光度值为0.792±0.106，与染料木素组相比，差别有统计学意义（q=4.25，P&<0.01）。
　　2.2 ICI182，780和JB1对染料木素诱导的IGF1R mRNA表达的影响
　　对照组扩增产物灰度值比值为1.065±0.053，染料木素组为1.566±0.028，两组差别有显著性(F=21.695，q=4.94，P&<0.01)；而染料木素+ICI182，780组灰度值比值为0.799±0.023， 与染料木素组相比差别有统计学意义（q=5.03，P&<0.01）;染料木素+JB1组灰度值比值为0.885±0.017，与染料木素组相比差别有统计学意义（q=5.89，P&<0.01）。
　　3 讨论
　　染料木素含有一个芳香族A环，其化学结构类似于雌激素，在很多组织中已被广泛证明具有雌激素样作用。染料木素对ER阳性的MCF7细胞的增生具有双向作用，高浓度的染料木素（&>10 μmol/L）可以抑制MCF7细胞的增生[6]，而低浓度的染料木素（&<10 μmol/L）则对MCF7细胞的增生具有促进作用[7]。本文实验结果显示，1 μmol/L的染料木素可以促进MCF7细胞的增生和IGF1R基因的表达，此效应可以被ER拮抗剂ICI182，780和IGF1R拮抗剂JB1完全阻断。
　　IGF1R是一种广泛存在于细胞膜表面的酪氨酸激酶受体，在细胞生存和细胞增殖中发挥重要作用。IGF1R是乳腺组织正常发育所必需的。但临床和实验资料均显示，IGF1R参与了乳癌的发生过程[7]。ER阳性的MCF7细胞中，IGF1R的表达水平明显高于正常的上皮细胞，IGF1R介导的信号途径与ER介导的信号途径可以交互作用，从而促进MCF7细胞的有丝分裂[4]，进一步增加乳癌的危险性[8]。

转贴于 　　研究表明，雌激素可在不同的水平激活IGF1R信号途径。雌激素与雌激素受体结合，可以通过接头蛋白与IGF1R交互作用，激活IGF1R的信号通路，增强IGF1R、IRS1及IGFBPs的表达[9]。染料木素是已知的一种植物雌激素，可刺激雌激素受体表达阳性的细胞增生，其作用机制是否通过与ER结合，激活IGF1R信号途径，目前尚未见报道。本研究应用ER阻断剂ICI182，780，能够完全阻断染料木素诱导的MCF7细胞增生和IGF1R基因表达的增加。揭示染料木素对MCF7细胞增生的促进作用是通过ER来完成的。为进一步探讨其详细的作用途径，本研究应用IGF1R拮抗剂JB1。JB1可高选择性地与IGF1R结合，阻断细胞膜表面的IGF1R自身磷酸化，从而阻断IGF1R信号转导途径。结果显示，染料木素诱导的细胞增生和IGF1R基因表达的增加可以被JB1完全阻断，表明染料木素可在细胞膜表面通过ER与IGF1R的相互作用，促进MCF7细胞的增生和IGF1R基因的表达。
　　综上所述，本研究结果证实，染料木素可以促进ER阳性的MCF7细胞增生和IGF1R基因的表达，其作用机制是通过ER与IGF1R的相互作用，激活IGF1R的信号转导途径。
【参考文献】
　　[1]MAKIEWICZ L， GAREY J， ADLERCREUTZ H， et al. In vitro bioassays of nonteroidal phytoestrogens [J]. J Steriod Biochem Mol Biol， 1993，45:399405.

　　[2]周政刚，陈晓亮，王德春，等. 雌激素受体α基因多态性与原发性骨质疏松的关系[J]. 青岛大学医学院学报， 2007，43(4)：359360.

　　[3]HSIEH C Y， SANTELL R C， HASLAM S Z， et al. Estrogenic effects of genistein on the growth of estrogen receptorpositive human breast cancer (MCF7) cells in vitro and in vivo[J]. Cancer Res， 1998，58:38333838.

　　[4]JORGENSEN M， VENDELBO B， SKAKKEBAEK N E， et al. Assaying estrogenicity by quantitating the expression levels of endogenous estrogenregulated genes[J]. Environ Health Perspect， 2000，108:403412.

　　[5]KATO S， MASUHIRO Y， WATAMABE M， et al. Molecular mechanism of a crosstalk between oestrogen and growth factor signaling pathways[J]. Genes Cells， 2000，5:593601.

　　[6]CHEN W F， HUANG M H， TZANG C H， et al. Inhibitory actions of genistein in human breast cancer (MCF7) cells[J]. Biochim Biophys Acta， 2003，1683:187196.

　　[7]SURMACZ E. Function of the IGFⅠ receptor in breast cancer[J]. J Mammary Gland Biol Neoplasia， 2000，5:95105.

　　[8]MARTIN M B， STOICA A. Insulinlike growth factorⅠ and estrogen interactions in breast cancer[J]. J Nutr， 2002，132:3799S3801S.

　　[9]MENDEZ P， AZCOITIA I， GARCIASEGURA L M. Interdependence of oestrogen and insulinlike growth factorⅠ in the brain: potential for analysing neuroprotective mechanisms [J]. J Endocrino， 2005，185:1117.转贴于