关于扇贝多肽经SmacXIAP通路抑制UVB诱导HaCaT细胞凋亡的作用

　　　　　　 作者：张兰兰 苏爱 刘颖 孙谧 王春波 杜卫

【摘要】 目的 探讨扇贝多肽（PCF)经半胱天冬酶激活物(Smac）和X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)通路对抑制中波紫外线（UVB）诱导HaCaT细胞凋亡的分子机制。方法 实验分为如下6组：正常对照组（A组）、UVB模型组（B组）、UVB+1.42 mmol/L PCF组（C组）、UVB+2.84 mmol/L PCF组（D组）、UVB+5.68 mmol/L PCF组（E组）和UVB+5.68 mmol/L维生素C阳性对照组（F组），分别进行相应处理。分别采用琼脂糖凝胶电泳和Hochst 33258染色法测定各组细胞凋亡率，蛋白印迹法（Western blot）检测胞浆内Smac的水平，RTPCR检测XIAP mRNA表达。结果 B组与A组比较，细胞凋亡率显著降低（F=165.096，q=36.535，P&<0.01)，胞浆Smac明显增加（F=174.311，q=33.106，P&<0.01)，XIAP mRNA表达显著减少（F=97.141，q=26.147，P&<0.01)；预先加入药物各组（C、D、E、F组）与B组相比，细胞凋亡率降低（q=11.369～28.592，P&<0.01)；C、D、E组与B组相比较，胞浆Smac含量明显降低（q=9.191～26.180，P&<0.01)，XIAP表达增加（q=8.073～17.618，P&<0.01)。且随着PCF浓度的增加，细胞凋亡率降低（q=7.259～9.965，P&<0.01)，胞浆Smac含量降低（q=6.926～10.063，P&<0.01)，XIAP表达增加（q=3.706～5.839，P&<0.05)。结论 PCF在1.42 ～5.68 mmol/L浓度范围内可呈剂量依赖性地抑制Smac从线粒体释放到胞浆，上调XIAP mRNA 的表达，抑制caspase3的活化，从而抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡。
【关键词】 细胞凋亡；紫外线；信号传导；分子作用机制
中波紫外线（UVB）辐射能诱导HaCaT细胞发生凋亡[1]，长期过度的照射可导致皮肤癌的发生，严重危害人类的健康。目前，人们广泛应用人工合成抗氧化剂防护紫外线损伤，但人工合成抗氧化剂多为大分子蛋白或糖肽，不易被人体吸收。扇贝多肽（PCF)是自海洋贝类栉孔扇贝废弃物中提取的水溶性小分子多肽， 属于海洋抗氧化剂。我们以往的研究表明， PCF可有效地保护人真皮成纤维细胞对抗UVB的辐射损伤[2]。近期研究显示，线粒体内包含一些与细胞凋亡密切相关的物质，如半胱天冬酶原、细胞色素、半胱天冬酶激活物(Smac）、凋亡诱导因子等，在凋亡刺激因素（UV）的作用下，线粒体膜的通透性增加，凋亡相关物质释放出线粒体，诱导细胞凋亡。已有研究结果证实，Smac和X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)参与了大鼠脑外伤或脑缺血引起的神经元凋亡机制[3]。更有研究显示，转染XIAP、Smac的野生型NT2细胞经25 J/m2紫外线照射后，Smac释放入胞浆与胞浆内XIAP结合，且细胞凋亡显著增加[4]。本研究以HaCaT细胞为研究对象，复制UVB辐射损伤HaCaT细胞凋亡模型，从线粒体内源性凋亡通路SmacXIAPcaspase3探讨PCF对UVB辐射HaCaT细胞的保护作用及其机制。
　　1 材料和方法
　　1.1 试剂与仪器
　　1.1.1 试剂 完全培养基，由DMEM (Gibco公司)、体积分数为0.10的标准胎牛血清（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）、100 kU/L青霉素和100 kU/L链霉素组成；PCF由中国水产科学研究院黄海水产研究所分离纯化，纯度&>96%，蒸馏水配制成227.5 mmol/L的储存液，过滤除菌，4 ℃保存备用；DNA Ladder抽提试剂盒、Hoechst 33258染色试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；RNAiso Reagent、逆转录试剂盒和PCR扩增试剂盒均为大连宝生物工程有限公司产品；Smac 抗体购自eBioscience；XIAP抗体购自Cell Signaling Technology TM(Beverly， MA， USA)；caspase3和9 抗体购自北京博奥森公司。 XIAP和GAPDH引物由北京三博远志生物技术有限公司合成；预染蛋白质相对分子质量标准、BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所；βactin 抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。
　　1.1.2 仪器 紫外线辐照仪（北京师范大学光电仪器厂制造）， Leica DBI 4000 B荧光显微镜(Leica公司)，PCR仪（美国CLP公司）， PROTEAN Ⅱ型垂直电泳仪（美国BIORAD公司生产），DYYⅢ8 型电泳仪（北京六一仪器厂）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 细胞培养与实验分组 HaCaT细胞（韩国延世大学丁擘晓博士惠赠）加入完全培养基，置于37 ℃，体积分数0.50 CO2中常规培养。实验分为6 组：正常对照组（A组）、UVB模型组（B组）、UVB+1.42 mmol/L PCF组（C组）、UVB+2.84 mmol/L PCF组（D组）、UVB+5.68 mmol/L PCF组（E组）和UVB+5.68 mmol/L维生素C阳性对照组（F组）。将细胞种入置有盖玻片的6孔培养板内培养，细胞融合至50%～80%时，按实验分组进行处理。C、D、E组细胞在含有不同剂量PCF的培养液中预孵育2 h后， UVB照射（剂量20 mJ/cm2）；F组细胞在Vit C浓度为5.68 mmol/L的培养液中预孵育2 h后，UVB照射（剂量20 mJ/cm2），照射结束后继续常规培养。
　　1.2.2 Hoechst 33258染色检测细胞凋亡 各组细胞UVB照射结束后继续培养18 h， 吸尽各孔培养液，按照Hoechst 33258染色试剂盒说明进行操作，荧光显微镜下观察结果。同一处理组随机选择6个观察视野，每个视野观察200个细胞，计数凋亡细胞数，重复3次，计算细胞凋亡率。
　　1.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡 将细胞按实验分组处理后， 继续培养18 h。然后收集细胞，按照DNA Ladder抽提试剂盒说明进行操作。将获得的DNA应用20 g/L 琼脂糖凝胶电泳。
　　1.2.4 蛋白印迹法（Western blot）检测胞浆Smac水平 将按实验分组处理后的细胞继续培养8 h[5]，按文献[6]的方法提取胞浆蛋白，用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。100 g/L SDSPAGE电泳，每孔上样约25 μg蛋白质，电转移至硝酸纤维膜上，室温封闭2 h后加入Smac鼠多克隆一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次后， 加入1∶400稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育40 min；TBST洗膜3次后DAB显色液显色，实验重复3次。胞浆内蛋白质水平以蛋白质与βactin吸光度比值表示，应用凝胶分析软件Quantity one进行定量分析。
　　1.2.5 RTPCR检测细胞内XIAP mRNA的表达
　　按实验分组进行处理后，继续培养12 h， 提取总RNA。按ExscriptTM RT reagent kit 说明逆转录为cDNA备用。XIAP cDNA 引物序列分别为：上游为5′ATATACCCGAGGAACCCTGCC3′，下游为5′TTCCGGCCCAAAACAAAGA3′，扩增片段长度为245 bp；内参GAPDH的引物序列分别为：上游为5′CGTGGAAGGACTCATGACCA3′，下游为5′TCCAGGGGTCTTACTCCTTG3′，扩增片段长度为509 bp。按照PCR Amplification kit说明进行反应。扩增条件为：95 ℃预变性3 min；94 ℃ 40 s、60 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，循环35次；最后72 ℃延伸3 min。10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，实验重复3次。采用凝胶分析软件Quantity one进行半定量分析，XIAP mRNA的表达水平以XIAP与GAPDH比值表示。
　　1.3 统计学分析
　　
　　用SPSS 12.0软件进行数据处理，数据间比较采用单因素方差分析。
　　2 结果
　　2.1 PCF抑制UVB诱导HaCaT细胞凋亡作用
　　
　　琼脂糖凝胶电泳结果显示，B组有明显的DNA梯形条带，且梯形带灰度较高，A、F组及加入PCF各组（C、D、E组）均未见明显的梯形条带（图1）。
　　图1 DNA Ladder琼脂糖凝胶电泳图（略）
　　
　　M：2 000 bp DNA Marker；A：正常对照组，未见梯形条带;B：UVB模型组，可见明显的梯形条带；C：UVB+1.42 mmol/L PCF组，未见明显的梯形条带;D：UVB+2.84 mmol/L PCF组，未见明显的梯形条带；E：UVB+5.68 mmol/L PCF组，未见明显的梯形条带；F：UVB+ 5.68 mmol/L Vit C阳性对照组，未见梯形条带
　　显微镜下，A组细胞核形态规则，表面光滑，发出均匀的微弱的蓝色荧光；B组细胞核致密浓染，呈现核浓缩、边缘化或碎裂，发出亮蓝色荧光。F组及C、D、E组细胞核致密浓染，核浓缩、边缘化或碎裂的细胞数量明显减少。B组与A组比较，细胞凋亡率明显增加（F=165.096，q=36.535，P&<0.01)，预先加入药物各组（C、D、E、F组）与B组比较，细胞凋亡率减少，差异有显著性（q=11.369～28.592，P&<0.01)；随着PCF浓度的增加，细胞凋亡率减少，差异有显著性（q=7.259～9.965，P&<0.01)。见表1。
　　2.2 PCF对UVB辐射的HaCaT细胞线粒体Smac释放的影响
　　
　　SDSPAGE凝胶电泳结果显示，B组与A组相比较，胞浆Smac含量明显增加（F=174.311，q=33.106，P&<0.01)，预先加入药物各组（C、D、E组）与B组相比，胞浆Smac含量明显降低，差异有显著性（q=9.191～26.180，P&<0.01)；且随着PCF浓度的增加，胞浆Smac含量明显降低，差异有显著性（q=6.926～10.063，P&<0.01)。见表1。
　　2.3 PCF对UVB辐射的HaCaT细胞内XIAP表达的影响
　　
　　B组与A组相比较，XIAP mRNA的表达显著降低（F=97.141，q=26.147，P&<0.01)，预先加入PCF各组（C、D、E组）与B组相比，差异有显著意义（q=8.073～17.618，P&<0.01)，且随着PCF浓度的增加，XIAP mRNA的表达显著降低，差异有显著性（q=3.706～5.839，P&<0.05)。见表1、图2。
　　表1 各组HaCaT细胞凋亡指标的比较（略）
　　与A组比较，F=97.141～174.311，*q=26.147、33.106，P&<0.01;与B组比较，#q=8.073～28.592，P&<0.01；与C组比较，△q=5.839～9.965，P&<0.01;与D组比较，※q=3.706～10.063，P&<0.05
　　图2 XIAP mRNA基因表达琼脂糖凝胶电泳图（略）
　　
　　A：正常对照组；B：UVB模型组；C：UVB+1.42 mmol/L PCF组;D：UVB+2.84 mmol/L PCF组；E：UVB+5.68 mmol/L PCF组

　3 讨论
　　
　　许多研究已证明，紫外线可诱导体内及体外培养的人类正常角质形成细胞发生凋亡。角质形成细胞是表皮的主要构成细胞。本文研究对象HaCaT细胞为永生化人类角质形成细胞。有研究表明，HaCaT细胞经UVB（500 J/m2）或UVC(100 J/m2)照射后，线粒体膜间隙蛋白细胞色素C和Smac释出，激活caspases级联反应，细胞发生凋亡[7]。由于线粒体在控制细胞凋亡中起主导作用，已成为目前细胞凋亡研究的热点。本实验通过复制UVB辐射HaCaT细胞的损伤凋亡模型，从线粒体内源途径探讨了PCF的保护作用及相关机制。
　　
　　细胞凋亡的测定有多种检测方法，本实验采用了Hoechst 33258染色与寡核苷酸片段分析相结合的方法。Hoechst 33258染料能特异性结合细胞内的DNA，使细胞核发出淡蓝色荧光。染色后，在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核呈致密浓染或碎块致密浓染。根据细胞凋亡时DNA断裂形成不同倍数的180～200 bp核酸片段，在琼脂糖凝胶电泳上可呈现阶梯状条带(DNA ladder)特征。我们又进一步观察了PCF对UVB诱导HaCaT细胞凋亡的影响，结果显示，1.42 ～5.68 mmol/L剂量范围内的PCF可明显降低UVB诱导的HaCaT细胞的凋亡率。琼脂糖凝胶电泳结果显示，UVB辐射HaCaT细胞可诱导明显的DNA ladder 形成，不同浓度的PCF预处理细胞均可有效抑制UVB引起的DNA ladder 的形成。
　　
　　Smac是2000年由DU等[8]与ANNE等[9]几乎同时发现的一种促凋亡分子，是caspases的激活剂。JIA等[10]将未剪接的成熟Smac转染到白血病细胞K562和CEM，检测显示白血病细胞对UV和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL)所致凋亡的敏感性升高，caspase3和caspase9的活性亦明显升高。本研究显示，与正常对照组相比，模型组HaCaT细胞胞浆内Smac表达明显增高。
　　
　　凋亡蛋白抑制剂(IAPs)家族是近年发现的一类新的细胞内凋亡调控蛋白，是1993年CROOK 等[11]在鉴定病毒感染的调节子过程中从杆状病毒中发现的。Survivin 是IAPs中的一员，有研究表明，Survivin 基因表达在白血病细胞的增殖分化和(或) 抗凋亡过程中发挥了重要作用[12]。 XIAP是IAPs中最有效的caspases抑制剂[13]。细胞受凋亡刺激后，Smac可从线粒体释放入胞浆，与caspases竞争结合XIAP的重复序列，恢复caspases活性。目前普遍认为caspase3是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶，它单独或协同参与水解许多与凋亡有关的蛋白质。本研究显示，与正常对照组相比，模型组HaCaT细胞XIAP的基因表达降低。
　　
　　本文研究结果表明，与UVB模型组相比较，PCF可抑制UVB辐射HaCaT细胞8 h后胞浆内Smac蛋白水平的增加，上调辐射12 h后XIAP的基因表达，从而抑制caspase3的活化，辐射后18 h检测到明显的细胞凋亡。本文研究结果表明，线粒体通路SmacXIAPcaspase3参与了UVB诱导的HaCaT细胞凋亡。

参考文献

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