关于人肝癌组织中nm23H1基因突变的检测及意义

【摘要】 目的 观察肿瘤转移抑制基因nm23H1在人原发性肝细胞癌中的突变情况，探讨nm23H1基因突变与肝癌发生、发展及转移的关系。方法 采用聚合酶链反应单链构象多态性技术(PCRSSCP)，对16例肝癌组织、12例癌旁组织和4例正常肝组织的nm23H1基因的第1、2、4外显子突变情况突变进行检测。结果 肝癌组织中有1例nm23H1基因第1外显子纯合缺失；肝癌组织中1例第1外显子、1例第2外显子，癌旁组织中2例第2外显子有单链DNA泳动变位。结论 nm23H1基因突变在肝癌组织中发生率低。
【关键词】 肝肿瘤 nm23H1基因 突变 聚合酶链反应
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the mutation of nm23H1 gene and to explore the relationship between nm23H1 mutation and the development， progression and metastasis of human hepatocellular carcinoma （HCC）. MethodsMutations of the exon1，2，4 of nm23H1 gene in 16 HCC tissues， 12 adjacent liver tissues and four normal liver tissues were examined by polymerase chain reactionsingle strand conformation polymorphism (PCRSSCP). ResultsOne of exon 1 homozygous loss of allele of nm23H1 gene was observed in HCC tissue. The mobility shift of single strand DNA of nm23H1 was also examined including one of exon1 in HCC tissues， one of exon 2 in adjacent liver tissue and two of exon 2 in adjacent liver tissue. ConclusionThe incidence of mutation of nm23H1 gene in HCC is low.
　　［KEY WORDS］liver neoplasms; nm23H1; mutation; polymerase chain reaction
　　原发性肝细胞癌(HCC)是消化系统常见的恶性肿瘤，目前还缺乏有效的治疗方法，肿瘤细胞转移是造成病人死亡的重要原因。近年来通过分子克隆技术发现一类参与调控肿瘤转移的基因，这类基因的失活、突变或表达异常，可导致肿瘤的转移，故称为转移抑制基因。已经发现的转移抑制基因包括nm23、TIMP和WDNMI等，其中尤以nm23基因与肿瘤转移的关系密切。nm23基因对肿瘤细胞转移潜能的抑制作用较明确，但对nm23基因抑制肿瘤转移的机制尚不清楚。临床研究发现，nm23基因缺失或表达降低与多种肿瘤的发生和转移关系密切，也有在部分肿瘤中未检测到nm23基因改变的报道［1］。近年来，国内外主要是通过免疫组织化学的方法检测nm23H1 mRNA的表达及蛋白产物(NDPK)的变化来研究nm23H1基因在肝癌转移中的作用，而对nm23H1基因突变的研究国内外报道较少。为探讨nm23H1基因在肝癌组织中的突变情况，本研究采用聚合酶链反应单链构象多态性技术(PCRSSCP)在基因水平对nm23H1基因第1、2、4外显子进行了突变分析。
　　1 材料和方法
　　1.1 组织标本
　　标本来自2004年1月～2005年8月青岛大学医学院附属医院肝胆外科手术病人。16例为肝细胞癌病人，其中男10例，女6例，年龄45～72岁。术中16例取癌区、12例取癌旁区（距癌边缘2～5 cm）组织标本。4例肝血管瘤病人，均为男性，年龄35～59岁，术中取正常肝组织标本。组织离体后放入-20 ℃冰箱冻存。病人诊断均符合1990年全国第6届病毒性肝炎学术会议修订的临床诊断标准，并经术后病理诊断证实。
　　1.2 组织DNA的提取
　　取米粒大小肝组织，使用上海生工生物工程公司基因组DNA提取试剂盒提取肝组织基因组DNA，-20 ℃冰箱冻存。
　　1.3 PCR引物合成
　　本文引物设计根据GenBank Database(ACCESSION X75598)提供的nm23H1基因全序列，参考BAFICO等［2］的方案，设计扩增nm23H1基因第1、2、4外显子的引物(表1)。由上海生工生物工程公司合成。表1 引物序列及扩增基因片段长度
　　1.4 PCR扩增
　　PCR反应体系包括：模板DNA 100 ng，每种引物各10 μmol/L，10 mmol/L dNTPs 2.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，TaqDNA聚合酶0.5 U，加灭菌双蒸水至25 μL。扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55～63 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环30次；72 ℃再延伸5 min。PCR试剂均购自上海生工生物工程公司。
　　1.5 SSCP分析
　　参照王修海等［3］的方法略有改进。取PCR扩增产物5 μL，加入等体积变性液(9.8 g/L甲酰胺，10 mmol/L NaOH，20 mmol/L EDTA，0.5 g/L溴酚蓝，0.5 g/L二甲苯氰)，加入等体积的蔗糖溶液(100 g/L)，混匀后98 ℃变性10 min；迅速置于-20 ℃冰箱10 min；全部上样于60 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳(丙烯酰胺∶Ｎ，Ｎ′甲叉双丙烯酰胺=29∶1)，使用pH 8.0的0.5×TBE作为电泳缓冲液，恒压160 V，15 mA，室温电泳4 h，凝胶用5 g/L硝酸银染色，观察结果并照相记录。
　　2 结　　果
　　2.1 PCR扩增结果
　　在所检测的肝癌、癌旁及正常肝组织中，仅有1例肝癌组织中nm23H1基因第1外显子经多次扩增未成功(每次扩增均设阳性、阴性对照，同一标本第2、4外显子扩增成功，确定为第1外显子等位基因纯合缺失)。其他标本中各外显子均扩增成功，扩增产物片段大小与设计理论值完全相同。nm23H1基因的3个外显子扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳结果见图1。
　　2.2 SSCP分析结果
　　在肝癌组织中有1例第1外显子、1例第2外显子单链DNA泳动变位，癌旁组织中有2例第2外显子单链DNA泳动变位。在两种组织中均未发现第4外显子的泳动变位。正常肝组织中nm23H1基因各外显子无泳动变位。在所检测的32例标本中，第1、2、4外显子突变发生率分别为3.23%、9.38%、0。肝癌、癌旁与正常肝组织中基因突变的发生率无显著差异(χ2=2.40，P＞0.05)。第1、2外显子间基因突变的发生率无显著差异(χ2=0.23，P＞0.05)。nm23H1基因SSCP分析结果见图2。
　　3 讨　　论
　　nm23基因首先是由美国国立癌症研究所的STEEG等［4］于1988年在鼠黑色素瘤细胞系中分离出来的细胞克隆，在人类已发现4种nm23基因，包括nm23H1、nm23h3、nm23H3、nm23H4。其中nm23H1定位于染色体17q21.3，全长8.5 kb，由5
　　1期赵炜，高洪梅，刘世国，等.人肝癌组织中nm23H1基因突变的检测及意义65
　　个外显子和4个内含子组成，基因全部编码由533个核苷酸组成，产生的蛋白质含有152个氨基酸。nm23基因是近年来研究最多的一种肿瘤转移抑制基因，大量研究结果显示，nm23基因缺失或表达降低与多种肿瘤的发生和转移关系密切，而且nm23基因有可能是肿瘤转移调控过程中的上游基因［5］。SHIMADA等［6］研究表明，nm23的表达与肝癌的转移潜能无关，而且在肿瘤组织的表达较相邻正常组织明显升高，在分化差的肿瘤组织中其mRNA水平明显升高，认为nm23H1的表达不是肝癌在肝内转移和远处转移的可靠指标，nm23H1 mRNA水平的升高与肝细胞癌的进展有关。LIU等［7］研究表明，nm23H1基因表达的降低可作为肝癌病人术后转移与复发的指标，nm23H1表达较低的肝癌手术切除后，复发率较nm23H1高表达者显著增高。由此可见，关于nm23基因表达和肝癌转移的研究结果不尽相同。
　　关于nm23H1基因改变，LEONE等［8］首先对109例不同肿瘤组织的结果表明，64%乳癌、42%非小细胞肺癌、20%肾癌及22%结肠癌有nm23H1等位基因缺失。COHN等［9］研究了21例结肠癌，发现nm23H1等位基因缺失者远处转移发生率高，第一次显示了nm23H1基因位点上的改变对肿瘤预后有重要意义。本研究在32例标本中仅有１例肝癌组织nm23H1第1外显子等位基因纯合缺失。与乳癌、肺癌、肾癌及结肠癌等肿瘤相比，等位基因缺失的发生率明显偏低。

转贴于 　　nm23H1基因突变在某些肿瘤组织中的研究有少量报道，研究表明，nm23H1基因突变在肺癌中发生率很低，在45例肺癌病人中仅发现1例nm23H1基因第1外显子突变［10，11］。也有在结肠癌、子宫内膜癌、甲状腺癌等肿瘤中未发现nm23H1基因突变的报道。国内外有关nm23H1基因缺失和突变与HCC的关系，仅有LIN等［12］对18例肝癌组织及其相邻正常肝组织进行了对比研究，Southern印迹分析表明，在肝细胞癌中nm23H1既没有扩增也没有杂合性丢失(LOH)，没有发现nm23H1基因突变。本研究在检测等位基因缺失基础上通过PCRSSCP分析了nm23H1基因第1、2、4外显子突变情况，发现肝癌组织中1例第1外显子、1例第2外显子突变，癌旁组织中2例第2外显子突变，说明本实验所检测的nm23H1基因突变在肝癌组织中发生率较低，其基因突变与HCC发生、发展及转移的关系尚不能确定，nm23H1基因是否抑制肝癌转移及其机制有待进一步的研究。

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