关于fat1转基因小鼠的构建与鉴定

【摘要】 目的 构建和鉴定携带有外源fat1基因的转基因小鼠。方法 将fat1基因的cDNA与动物表达载体pEFneo连接，构建pEFfat1重组质粒， 酶切、测序鉴定正确后，以显微注射法把线性化重组质粒注射到小鼠受精卵的雄原核中，并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中产出转基因小鼠，通过PCR、Southern blot杂交等方法确立阳性整合有目的基因的G0代小鼠。结果 成功构建了pEFfat1重组质粒，将其显微注射到小鼠受精卵中，得到G0代小鼠，PCR、Southern blot杂交确立了4只整合有fat1基因的首建鼠。结论 fat1基因可整合到小鼠体内，得到的转基因小鼠为研究fat1基因的生物学功能提供了动物模型。
【关键词】 小鼠 转基因 DNA 重组 fat1基因
［ABSTRACT］ObjectiveTo construct and identify the transgenic mice with extrinsic fat1 gene. MethodsFat1 cDNA and animal expression vector pEFneo were conjugated to construct the recombinant plasmid pEFfat1 which was digested by restrict enzyme and sequenced correctly. The obtained linear recombinant plasmid pEFfat1 was microinjected into the arsenoblasts of mouse zygote， which was implanted into the uterus to produce transgenic mice. PCR and Southern blot were performed to identify the positive G0 generation of fat1 transgenic mice. ResultsRecombinant plasmid pEFfat1 was successfully constructed and four G0 mice with integrated fat1 gene were identified via PCR and Southern blot.ConclusionFat1 gene can be integrated into mouse to obtain the transgenic mouse that provides an animal model for the study of fat1 gene.
　　［KEY WORDS］mice， transgenic; DNA， recombinant; fat1 gene
　　fat1基因来源于小秀丽线虫，SPYCHALLA等［1］利用在阿拉伯芥（Arabidopsis）中进行异种表达的方法确认了fat1 cDNA的序列。此cDNA 的翻译产物是由402个氨基酸组成的n3多聚不饱和脂肪酸（PUFAs）脱氢酶，相对分子质量为4.64万，是氧离子依赖的含铁酶，属于跨膜蛋白超家族。此酶的功能是以16～20碳的n6 PUFAs为底物进行脱氢反应，生成相应的n3 PUFAs。体外实验表明， fat1 cDNA的表达可促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，保护神经细胞，并可改变细胞膜n6/n3 PUFAs的比例，降低来源于n6 PUFAs的类花生酸的组成 ［2～7］。本文旨在构建和鉴定fat1转基因小鼠，从而为fat1基因在动物整体水平上的研究提供实验模型。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　菌株XL1Blue及pEFneo质粒由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供。pcDNAfat1质粒(内含fat1 cDNA)由本室保存。各种限制性内切酶、DNA分子质量标准λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ及T4 DNA连接酶等均购自Promega公司；PCR引物由上海生工公司合成，DNA测序由北京三博远志生物公司完成。琼脂糖购自华美生物工程公司。DNA凝胶回收试剂盒购自Omega公司。其他试剂均为国产分析纯。
　　1.2 方法
　　1.2.1 重组质粒pEFfat1的构建 pcDNAfat1及表达载体pEFneo用EcoRⅠ/XbaⅠ进行双酶切，8 g/L琼脂糖凝胶电泳，分别回收、纯化1.3 kb片段和大片段。将1.3 kb的目的片段和载体片段以摩尔比3∶1连接，转化感受态大肠杆菌XL1Blue后，用小量碱裂解法提取重组质粒。
　　1.2.2 重组质粒pEFfat1的鉴定 据相应酶切图谱，上述提取的重组质粒分别用EcoRⅠ/XbaⅠ、BglⅡ、XhoⅠ进行酶切鉴定，将阳性重组子命名为 pEFfat1。
　　1.2.3 重组质粒pEFfat1的序列测定 将酶切鉴定为阳性重组子的pEFfat1送交北京三博远志生物公司进行全自动序列测定。
　　1.2.4 转基因小鼠的获得 pEFfat1经SpeⅠ/BamHⅠ双酶切后，8 g/L琼脂糖凝胶电泳分离回收 5.5 kb的大片段，纯化，最后溶解于微注射缓冲液（内含10 mmol/L Tris HCl ，pH 8.0，0.1 mmol/L EDTA）中，并准确调整DNA至 3 mg/L，以3 pL的量注射到小鼠受精卵的雄原核中，并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中。小鼠为清洁级昆明白小鼠。
　　1.2.5 转基因小鼠的整合检测 提取4～6周龄G0代转基因小鼠尾尖DNA，用PCR法测定G0代转基因动物的整合情况。所用引物为:上游5′GTAGCCT TGCAGAAGT TGGTCG3′；下游5′GACG G AAAGCATCCACAGTTGG3′。 扩增条件为：94 ℃、3 min，94 ℃、40 s，55 ℃、40 s ，72 ℃、1 min，72 ℃、8 min，30个循环， 扩增出的片段大小为440 bp。经PCR检测阳性的小鼠再经Southern blot杂交做进一步确定。探针为pEFfat1，经SpeⅠ/BamHⅠ双酶切获得。
　　1.2.6 转基因小鼠的饲养和繁育 小鼠的饲养条件为清洁级。将G0代转基因小鼠与正常小鼠交配产生G1代小鼠。根据遗传规律，鉴定至第5代时将得到稳定遗传的转基因小鼠。
　　2 结　　果
　　2.1 重组质粒pEFfat1的酶切鉴定及DNA序列测定
　　重组质粒分别经EcoRⅠ/XbaⅠ、 BgⅢ、XhoⅠ酶切鉴定，结果与原来载体和目的基因所带的限制性酶切位点相符。见图1。重组质粒pEFfat1的测序结果表明，载体与 fat1 cDNA接头部分及fat1 cDNA本身序列均正确，无碱基突变。
　　2.2 转基因小鼠的获得
　　将pEFfat1经SpeⅠ/BamHⅠ双酶切后回收纯化的片段显微注射到小鼠受精卵的雄原核中。共注射并移植受精卵738枚，存活的受精卵为486枚，将存活的受精卵移植到假母，成活的假母数为48只，最后生下42只G0代小鼠。
　　2.3 PCR检测阳性G0代小鼠
　　以上述42只G0代鼠尾DNA为模板，作PCR检测，共检测出阳性小鼠11只。部分结果见图2。
　　2.4 Southern blot检测阳性G0代小鼠
　　取PCR阳性样品作Southern blot杂交，结果显示有4只G0代小鼠基因组中整合有目的基因。见图3。将此阳性整合有外源基因的G0代转基因小鼠与正常小鼠交配产生G1代小鼠。
　　3 讨　　论
　　许多研究发现， n6 PUFAs可促进动物肿瘤的生长，而n3 PUFAs则能抑制动物肿瘤的生长。临床研究显示，给乳癌和直肠癌病人的饮食中添加n3 PUFAs，可减轻或抑制肿瘤的发展［8，9］。补充n3 PUFAs对炎症和自身免疫病，如关节炎，具有治疗效果［10］。因此，n3 PUFAs已日益成为研究的热点，人们更加注意到它作为药物和营养类化合物的价值。

另一些研究表明，对于维持细胞的稳态和正常生长起关键作用的是n6/n3 PUFAs的比例，而不是两者的绝对值［11］。仅仅通过饮食摄取足量的n3 PUFAs的效率很低，很难满足机体的需要，这使得在哺乳动物体内迅速增加n3 PUFAs非常困难。
　　n3 PUFAs或n6 PUFAs的合成是分别通过对亚油酸（LA）或 亚麻酸(ALA)进行一系列脱氢和延长来完成的。动物细胞缺乏脱氢酶活性，n6和n3 PUFAs也不可相互转化。所以，ALA及对应的延长产物（n3 PUFAs）就成为人类的必需脂肪酸。但是，一些植物和微生物具有能合成n3脂肪酸ALA的基因，如fat1。该基因来源于小秀丽线虫，mRNA全长1.4 kb，其功能可将n6 PUFAs脱氢转化成相应的n3 PUFAs。当把该基因在植物阿拉伯芥中进行表达时，通过把n3双键引入到n6 PUFAs碳氢链中，能催化n6 PUFAs转化成为n3 PUFAs［1］。
　　以往的研究证明，利用腺病毒介导的fat1基因转移，可在体外培养的动物细胞中表达，且影响细胞的功能［2～7］。然而，fat1基因是否能在动物体内表达并发挥类似的功能，还有待于研究，为此需要建立一个fat1转基因动物模型。本文结果表明，fat1基因可导入动物体内，并得到了fat1基因G0代转基因小鼠，这为在动物整体水平上研究此基因功能奠定了一个实验基础。
【参考文献】
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