作者：山峰 何俊峰 宋暖 刘淑红 李堃 王静 王秋波
【摘要】 目的 观察维拉帕米和生脉注射液对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。方法 将40只大鼠分为假手术组（A组）、缺血再灌注组（B组）、维拉帕米组（C组）和生脉注射液组（D组），每组10只。A组开腹后再关腹；B组开腹后夹闭左肝蒂30 min，再关腹；C组在开腹前静脉注射维拉帕米，开腹夹闭左肝蒂30 min，再关腹；D组在开腹前3 d每天经腹腔注射生脉注射液，开腹夹闭左肝蒂30 min，再关腹。各组均在关腹48 h后再开腹，每只大鼠取缺血肝组织检测查丙二醛（MDA）、热休克蛋白70（HSP70）的水平，光镜下观察肝组织的形态变化；取血检测谷丙转氨酶（ALT）、天门冬氨酸转氨酶（AST）、肿瘤坏死因子（TNF-α）的水平。结果 B、C、D组ALT、AST、TNF-α及MDA测定结果与A组比较均有显著性差异（F=5.10～53.01，q=1.38～17.58，P&<0.05）；C、D两组ALT、AST、TNF-α及MDA含量均低于B组，差异具有显著性（q=2.89～10.08，P&<0.05），而C、D两组以上各指标除ALT比较差异有显著性（q=2.97，P&<0.05）外，其他指标比较差异无显著性（P&>0.05）。C、D两组HSP70的表达明显少于B组，而C组HSP70的表达略少于D组；C、D两组肝细胞肿胀、坏死程度均较B组轻。结论 维拉帕米和生脉注射液可明显改善大鼠肝脏缺血再灌注后肝组织的损伤程度。
【关键词】 维拉帕米；生脉注射液；肝脏；再灌注损伤
［ABSTRACT］ Objective To observe the protective effect of Verapamil and Shengmai injection on ischemia-reperfusion injury in rat liver. Methods Forty healthy female Wistar rats were evenly randomized to sham operation group (group A)， the abdomen was opened and then closed; ischemia-reperfusion group (group B)， the blood supply of left hepatic lobe (LHL) was clamped for 30 minutes， the abdomen was then closed; Verapamil group (group C)， intravenous Verapamil was given before ope-ning abdomen， the blood supply of LHL was blocked as in group B， the abdomen closed; and Shengmai injection group (group D)， Shengmai injection was administered intraperitoneally three days before the experiment. The ischemia of the LHL was done same as in groups B and C. The liver tissue was collected at 48 hours after the procedures and sent for detection of heat shock protein 70 (HSP70)， Malondialdehyde (MDA). Serum tumor necrosis factor alpha (TNF-α)， alanine aminotrasferase (ALT)， and aspartate aminotrasferase (AST) were measured. Results Compared with group A， the levels of ALT， AST， TNF-α and MDA in groups B， C and D were significantly different (F=5.10-53.01，q=1.38-17.58，P&<0.05). The ALT， AST， TNF-α and MDA in groups C and D were significantly decreased than those in group B (q=2.89-10.08，P&<0.05). Except of the significant difference in ALT between groups C and D (q=2.97，P&<0.05)， no significant differences of other parameters were found between this two groups. The expression of HSP70 in groups C and D was obviously lower than that in group B. While the HSP70 in group C was slightly decreased than that in group D. Compared with group B， the liver cellular edema and necrosis in groups C and D were effectively alleviated. Conclusion Verapamil and Shengmai injection can improve ischemia-reperfusion damage of rat liver.
［KEY WORDS］ Verapamil; Shengmai injection; Liver; Reperfusion injury
肝脏缺血再灌注损伤是近些年肝脏外科特别是移植外科的研究热点之一。导致肝脏缺血再灌注损伤的原因很多，其确切的发病机制仍不十分清楚。近年研究结果提示主要与以下多种因素有关：肝细胞内钙离子超载、氧自由基生成、细胞因子的参与、Kupffer细胞激活及中性粒细胞的聚集、内皮素和一氧化氮浓度的失衡和微循环功能障碍等［1］，其中最为主要的是细胞内钙离子超载和氧自由基生成。为了探讨如何减轻肝缺血再灌损伤的方法，本研究通过动物实验观察了维拉帕米和生脉注射液对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物分组
雌性Wistar大鼠40只，体质量180~220 g。随机分为假手术组（A组）、缺血再灌注组（B组）、维拉帕米组（C组）和生脉注射液组（D组），每组10只大鼠。
1.2 实验方法
A组大鼠剖腹30 min后再关腹；B组大鼠剖腹后，用无创血管夹夹闭大鼠左肝蒂30 min，然后关腹；C组大鼠经尾静脉缓慢注射维拉帕米（1.25 mg/kg），10 min后开腹，余同B组；D组大鼠于剖腹前3 d内每日腹腔内注射生脉注射液（5 mL/kg），剖腹前30 min向腹腔内注射同剂量的生脉注射液，余同B组。均用30 g/L戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔内麻醉。4组大鼠在关腹48 h后再开腹，每只大鼠均取缺血肝组织2块，分别放入无菌小瓶中，1瓶送检热休克蛋白70（HSP70）、丙二醛（MDA），1瓶用40 g/L的甲醛溶液固定以备制作病理切片；由腹主动脉取血，分离血清检测TNF-α、ALT和AST。维拉帕米由上海禾丰制药有限公司生产，批号为3E12002；生脉注射液由常熟雷允上制药有限公司生产，批号为0406031。
1.3 观察指标的测定
1.3.1 ALT、AST 用全自动生化分析仪测定。
1.3.2 TNF-α 采用顺序饱和液相竞争放射免疫分析法检测，放射免疫分析试剂盒为北京中国原子能科学研究院产品。
1.3.3 MDA 取缺血肝组织匀浆，用硫代巴比妥酸法检测MDA的含量，试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。
1.3.4 HSP70 用Western blot法检测缺血肝组织中HSP70的表达，抗HSP70单克隆抗体（一抗）和HRP（辣根过氧化物酶）标记山羊抗小鼠IgG（二抗）购自北京中山生物技术有限公司。
1.3.5 肝组织形态学观察 用40 g/L的甲醛溶液固定缺血肝组织，石蜡包埋、切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察、照相。
1.4 统计学方法
全部数据用SPSS（11.0版本）统计软件处理，计量资料以x±s表示，统计处理采用方差分析，P&<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 动物存活情况
因手术的原因，导致B组大鼠死亡1只，C、D组大鼠各死亡2只。
2.2 各组ALT、AST、TNF-α、MDA结果比较
B、C、D组ALT、AST、TNF-α及MDA测定结果与A组比较均有显著性差异（F=5.10～53.01，q=1.38～17.58，P&<0.05）；C、D两组ALT、AST、TNF-α及MDA含量均低于B组，差异具有显著性（q=2.89～10.08，P&<0.05），而C、D两组以上各指标差异除ALT比较有显著性（q=2.97，P&<0.05）外，其他指标比较差异无显著性（P&>0.05）。见表1。
2.3 各组HSP70表达比较
C、D两组HSP70的表达明显少于B组，而C组HSP70的表达略少于D组；C、D两组肝细胞肿胀、坏死程度均较B组轻。各组HSP70的带宽和颜色深浅均不同，A组的色带最窄、颜色最淡，提示有微量的HSP70表达；B组的色带最宽、颜色最浓，提示HSP70的表达量最多；而C组和D组的色带较窄、颜色较浓，介于A、B两组之间，与B组比较有明显区别；C组和D组比较，C组的HSP70的表达又略弱于D组。
2.4 各组大鼠肝脏组织的病理改变
A组肝组织形态正常；B组大量肝细胞明显肿胀，中央静脉周围肝细胞大量坏死；C组和D组肝细胞轻度肿胀，中央静脉周围肝细胞呈小灶状或小片状坏死，两组之间无明显区别，而与B组比较则有较明显区别。 表1 各组ALT、AST、TNF-α、MDA结果比较
3 讨 论
肝脏缺血再灌注损伤是肝脏外科疾病中常见的病理生理过程，在休克的复苏、严重的肝外伤、肝门阻断的肝切除以及肝移植等过程中均不可避免地出现肝脏的缺血再灌注损伤，而它造成的组织损伤是影响上述疾病治疗效果的重要原因之一。因此，如何减轻肝脏缺血再灌注损伤是肝脏外科研究热点。
本实验以维拉帕米和生脉注射液为研究对象，观察这两种药物对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。维拉帕米是十分有效的钙离子阻滞剂， NAUTA等［7］最早将其应用于大鼠肝缺血后的再灌注损伤保护，发现维拉帕米在肝脏缺血前给药可明显减轻再灌注的损伤程度。在本实验中，维拉帕米组的ALT、AST、TNF-α、MDA等指标均低于缺血再灌注组，有显著性差异，HSP70的表达少于缺血再灌注组，组织病理亦显示肝细胞肿胀轻、小灶性坏死，而缺血再灌注组的大量肝细胞坏死，提示肝损伤的程度较缺血再灌注组明显减轻，与文献报道结果相符。此前已有医生将维拉帕米应用于手术中，以减少肝脏的缺血再灌注损伤［8］。
生脉注射液是将生脉散中的人参、麦冬、五味子制成可静脉注射的药物，含人参皂甙、麦冬皂甙、麦冬黄酮和五味子素等有效成分，中医认为其有益气生津，复脉固脱之效。国内应用生脉注射液对器官和组织缺血再灌注的保护研究多集中在心、肺、肠黏膜以及休克状态下的器官，而对肝脏缺血再灌注损伤保护研究的报道则极为少见。生脉注射液主要有以下药理作用：耐低氧、改善微循环、抗炎、提高免疫功能、改善呼吸功能、增强心肌收缩力等［8］。有学者通过对动物肠黏膜缺血再灌注损伤保护作用的研究显示，生脉注射液通过“多靶作用”发挥肠黏膜保护效应：清除氧自由基、调解细胞内钙稳态、抑制NO酶的活性、增加肠黏膜灌注及氧合［10］。本实验应用生脉注射液在大鼠肝缺血前给药，显示ALT、AST、TNF-α、MDA等指标与缺血再灌注组比较有显著差异，HSP70的表达比缺血再灌注组减少，组织病理也显示肝细胞肿胀轻、坏死范围小，提示生脉注射液对大鼠肝脏缺血再灌注损伤有明显的保护作用。
从本实验结果看，在大鼠肝脏缺血前给予维拉帕米和生脉注射液能够有效地保护大鼠缺血肝脏的再灌注损伤，为这两种药物在临床上的应用提供了有力的实验依据。
参考文献
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