［关键词］ 脑缺血;再灌注损伤;细胞黏附分子，神经元;基因表达;大鼠
［ABSTRACT］ObjectiveTo observe nerve cell adhesion molecule （NCAM） expression after reperfusion of focal cerebral is-chemia in rats. MethodsThe model of focal ischemic reperfusion in SD rats was induced by intraluminal middle cerebral artery （MCA） occlusion with a nylon monofilament suture. In situ hybridization was performed to examine the expression of NCAM mRNA at 2，6，12 h and 1，2，3，7，14 d after reperfusion. ResultsIn the cortex， NCAM mRNA expression was observed at 2 h after reperfusion， peaked at 12 h， and returned to basal level on day 14; in striatum， the expression reached the peak after one day， the rest were same as in the cortex. ConclusionThe sustained increase of NCAM expression following reperfusion suggests that the NCAM might play an important role in neural recovery.
［KEY WORDS］cerebral ischemia; reperfusion injury; cell adhesion molecules， neuron; gene expression;rats
神经细胞黏附分子（NCAM）是免疫球蛋白超家族中的一员，在神经元突触塑形，在脑、视神经、嗅神经组织中NCAM保持低水平表达。有证据表明，NCAM能促进控制学习功能脑组织的重塑并显著刺激神经细胞的生长［1］。NCAM参与神经元的黏附与神经生长，与突触结构的维持、模式重建及神经元出芽都有密切的关系。实验证实，NCAM能促进脑损伤后神经细胞的重塑。短暂性全脑缺血后，海马颗粒细胞的NCAM表达增加［2］，大脑中动脉缺血再灌注后，在纹状体的室下区也可见到NCAM表达增加［3］。本实验旨在探讨脑损伤后NCAM基因表达的变化规律及其在脑损伤后脑组织重新修复过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 动物和分组 成年健康雄性Sprague Dawley大鼠36只，体质量230～280 g，清洁级，由中国科学院上海实验动物中心提供。应用线栓法经左侧颈外-颈内动脉插 线建立左侧大脑中动脉缺血（MCAO）再灌注模型。随机分为缺血90 min再灌注2 h、6 h、12 h、1 d、 2 d 、3 d、7 d、14 d组和假手术组，每组4只。假手术组除不插线外，余步骤同实验组。
1.2 标本采集和组织切片制备 各组大鼠在规定的时间点取材，假手术组于手术后1 d取材。大鼠在100 g/L水合氯醛麻醉下，经左心室插管给予40 g/L多聚甲醛灌注固定后取脑，标本置入40 g/L多聚甲醛后固定2 h，蒸馏水浸泡4 h。常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，连续冠切片，厚度7 μm，粘于多聚赖氨酸处理后的玻片上，温室保存，用于NCAM mRNA原位杂交及其对照实验。
1.3 原位杂交检测 NCAM mRNA原位杂交试剂盒、DAB显色试剂盒均由武汉博士德生物工程有限公司提供。严格按照试剂盒说明操作，DAB显色30 min后水洗，封片。光镜下观察，细胞核或细胞浆出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。
1.4 统计处理 高倍镜下（400倍）每例标本在皮质区和纹状体 区随机各取4个不重叠的视野计数阳性细胞，数据以 x±s表示，组间比较采用t 检验。
2 结果
假手术组双侧半球和缺血组非缺血侧脑组织神经细胞NCAM mRNA均有微弱表达。缺血再灌注后缺血侧神经组织NCAM mRNA表达增强，主要位于皮质区及纹状体区，高倍镜下阳性信号位于细胞浆与细胞核内，呈棕黄色。皮质区:缺血再灌注后2 h神经细胞出现NCAM mRNA的表达，随着再灌注时间延长，阳性细胞数增多，于12 h达高峰，14 d后降至假手术组水平。纹状体区:缺血再灌注后 2 h 神经细胞出现NCAM mRNA的表达，随着再灌注时间延长，阳性细胞数增多，着色加深并于1 d达高峰，14 d后降至假手术组水平。见表1。
表1 脑缺血再灌注后皮质及纹状体区NCAM mRNA阳性细胞数（略） 与假手术组比较，*t=2.73～11.33，P &<0.05
3 讨论
NCAM是一个单链的跨膜糖蛋白，根据其糖基部分唾液酸的含量高低可分为两类，NCAM-H和NCAM-L［4］。胚胎发育早期和成年期，NCAM主要以NCAM-L的形式出现，主要分布在神经细胞、胶质细胞、肌肉、内分泌器官、生殖器官、泌尿系统中，也有少数区域如嗅觉系统和齿状回内细胞及部分苔状纤维等以MCAM-H的形式出现［5］，这些区域是突触塑形长期存在的区域。NCAM的一个最显著特征是含有以α 2～8键相连的多聚唾液酸糖链（PSA），PSA的存在与否会直接或间接调节细胞间的黏附能力。神经生长发育阶段及损伤修复阶段，在NCAM外围形成的带负电荷的PSA表达水平较高，随着发育成熟，PSA水平逐渐下降［6］。成年后仅在嗅神经、哺乳期的下丘脑等有突触形成或生理性塑形的区域内有PSA存在。在成年鼠脑中，内皮质和下丘脑失去联系后，脑齿状回外层PSA表达增 加［7］。上述结果表明，PSA的表达与突触塑形、神经生长是密切相关的。MILLER等［8］报道，PSA的增加最早出现在去神经后2 d，并可持续至60 d。亦有实验表明，只有去神经后的靶区能够接受移植的特定胚胎神经细胞的传入支配，这种能力可保留至去神经后60 d，而正常神经支配的靶区则没有这种能力。以上两研究的时程基本一致，因此可以推测PSA的增加降低了细胞间的黏附力，增加NCAM之间的排斥性，从而利于神经向外生长;PSA表达减少时，将增加NCAM黏附能力，维持原有细胞之间结构，不利于细胞的迁移和生长。本实验结果表明，脑缺血损伤后NCAM表达增加，在皮质区NCAM达到峰值的时间比纹状体稍早，大约在12 h时表达最多，而纹状体NCAM表达在24 h表达最为明显。NCAM表达增加可降低细胞间的黏附力，增加NCAM之间的排斥性，从而利于神经向外生长，因而NCAM可以作为神经干细胞的迁移阶段的标志。随着缺血时间延长，神经干细胞可能从皮质区向缺血中心区域迁移，以便向缺血中心区提供新生细胞，这对神经系统的发育和再生具有重要作用。由此推论，如能通过某些方法和途径激活NCAM，可为有效地治疗脑缺血再灌注损伤提供新的思路。
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参考文献
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