关于流式细胞仪检测HLAB27抗原在强直性脊柱炎诊断中的意义

作者：安新业 刘骙骙 陈佳荣 周玉明 阮月芹 李凤英

【摘要】 目的 经流式细胞仪(FCM)检测外周血T淋巴细胞表面HLAB27抗原，探讨其在强直性脊柱炎诊断中的临床意义。方法 分别用流式细胞仪和微量淋巴细胞毒法检测外周血T淋巴细胞表面HLAB27抗原并进行对比。结果 流式细胞仪检测86例强直性脊柱炎患者标本，79例阳性，微量淋巴细胞毒法检测为76例阳性。流式细胞仪和微量淋巴细胞毒法检测HLAB27抗原无显著性差异。结论 通过流式细胞仪检测HLAB27抗原，方法简便，稳定性好，重复性高。
【关键词】 HLAB27抗原；流式细胞仪；强直性脊柱炎
　　【Ａbstract】 Objective To study the clinical evaluation of HLAB27 by flow cytometry in the diagnosis of ankylosing spondylitis.Methods Microlymphocytotoxicity test and flow cytometry were adopted to detect HLAB27 expression and the following results were compared and analyzed.Results The positive incidence of HLAB27 with flow cytometry was 91. 86 % (79/86) in ankylosing spondylitis patients ， while the positive incidence with microlymphocytotoxicity was 88.37% (76/86). The difference between the two methods was not significant (P&> 0. 05).Conclusion The detection of HLA B27 expression with FCM is an easy ， stable ， accurate method with high repeatability.
　　【Key words】 HLAB27 antigen，flow cytometry，ankylosing spondylitis
　　
　　强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种原因未明的疾病，病变主要累及中轴骨骼和肌腱韧带骨附着点的慢性炎症性疾病［1］。早期以慢性双侧骶髂关节炎为特征，晚期骨突关节融合，韧带赘形成，脊柱韧带钙化，导致脊柱从颈到骶骨完全强直。一般患者要在发病后7年左右才能被诊断，早期诊断有助于早期治疗，防止致残。研究发现，HLAB27与AS的相关性是迄今为止所知的HLA与疾病相关性最强的，其相对危险度达87.4，超过90%的AS患者其HLAB27抗原表达阳性，普通人群中仅5 %～10%为阳性。人群中HLAB27亚型的研究和转基因动物模型的建立都有力地证实了HLAB27分子在AS发病中的重要作用［2］。本文采用荧光标记的单克隆抗体与细胞表面的HLAB27抗原相结合，通过流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞HLAB27的表达，并与微量淋巴细胞毒法进行比较。
　　1 对象与方法
　　1. 1 检测对象 2004年5月—2006年5月本院门诊及住院AS患者86例，男74例，女12例，年龄13～60岁，均符合AS诊断标准；病程3个月～9年，排除其它疾病。健康对照组40名，男28名，女12名，年龄15～58岁。
　　1. 2 方法
　　1. 2. 1 流式细胞仪法： 染色步骤:采静脉血1 ml，肝素抗凝。取30 μl抗HLAB27 FITC/抗CD3 PE抗体于试管中，加入50 μl抗凝血，混匀，室温避光孵育15 min。然后加入1∶10 稀释的裂解液2 ml，避光10 min，待红细胞完全溶解后，立即300 r/min离心5 min，弃上清，用PBS洗涤1次，同上离心后弃去上清。加入300 μl PBS重悬细胞，以备上机检测。FCM检测：先用CaliBRITE beads和HLAB27 calibration beads 调试机器，并通过试剂批号的后缀确定界值（decision maker）的位置。在BD公司的HLAB27自动软件下获取15 000个细胞，检测其中的T淋巴细胞HLAB27荧光强度，进行数据自动分析。
　　1. 2. 2 微量淋巴细胞毒法：抽取检测对象静脉血4 ml，肝素抗凝。用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，Hanks液清洗3次，将细胞浓度调整至2×106 ·ml1。取1 μl细胞悬液加于HLAB27板的抗体孔上，30 min后加5 μl的补体，室温孵育60 min。用5%伊红溶液5 μl 染色2 min，甲醛固定，4 ℃过夜，次日于倒置显微镜下观察阳性率。死细胞比例0～20%计为2分，30%～40%为4分，60%～80%为6分，80%～100%为8分。结果判定如下：阴性对照孔为2分，阳性对照孔为8分，符合此条件者为有效结果；HLAB27孔为4分或4分以上阳性，4分以下为阴性。 转贴于 　　1.3 统计学处理 采用SPSS 11. 0 统计软件包分析。
　　2 结果
　　
　　HLAB27自动软件首先通过FSCSSC点图，区分经裂解红细胞处理后外周血中淋巴细胞、粒细胞和单核细胞三个细胞群。然后在FSCFL2点图上确定CD3强阳性细胞群体的位置，自动设定一个CD3+ T淋巴细胞门，以去除体积过大或过小的细胞，确保门内至少有50%的细胞为CD3+ T淋巴细胞，根据FSCFL2双参数，可将随后进行的分析定位于T淋巴细胞。软件随后计算FSCFL2门内细胞抗HLA B27 FL1信号的平均荧光强度，并与界值比较，如果小于仪器设定的界值，为HLAB27阴性， 如大于(或等于)设定的界值为HLAB27阳性。通过流式细胞仪检测强直性脊柱炎患者共86例，其中HLAB27阳性79例，阳性率为91.86% 。健康对照组40例，其中HLAB27阳性4例，阳性率为10%。流式细胞仪和微量淋巴细胞毒法分别同时检测外周血T淋巴细胞HLAB27抗原，经χ2检验，P&> 005 ，两种检测方法检测HLAB27抗原无显著性差异，详见表1。
　　表1 流式细胞仪和微量淋巴细胞毒法检测HLAB27结果比较（略）
　　3 讨论
　　
　　强直性脊柱炎是一种严重危害人体健康的全身性疾病。流行病学资料显示， 本病的发病高峰年龄为20～30岁， 40岁以后发病少见， 男性比女性多见。过去认为AS是一种较少见的脊柱疾病， 随着风湿病学在我国的起步和发展， 认识到本病在国内并不少见。由于本病起病缓慢而隐匿， 首发症状多为十分常见的临床症状腰痛或外周关节痛， 临床上容易误诊。自开展HLAB27检测以来， 临床误诊明显减少，诊断准确率提高。目前检测HLAB27的主要方法有微量淋巴细胞毒试验、酶联免疫法、流式细胞术、PCR 法等。酶联免疫法适合大批标本检测，结果重复性好，但步骤稍显繁琐。微量淋巴细胞毒法最为常用，这种方法尽管其操作简便准确性尚可，但仍受细胞纯度、补体差异、单抗效价及HLA高度多态性的影响，易出现漏诊或假阳性［3］。流式细胞术是一种快速、简便、准确的检测HLAB27的方法， 其过程可自动进行， 每分析一份标本只需30 min ， 分析的值可被量化， 明显减少了人为因素影响。利用荧光标记的抗HLAB27的单克隆抗体和淋巴细胞表面的HLAB27抗原结合，激光照射细胞表面抗原结合的荧光抗体，使其发出荧光，这种荧光的强度可通过流式细胞仪测得的通道值反映。根据通道值的高低判断HLAB27抗原阳性或阴性。但应注意的是由于其检测的是淋巴细胞表面的HLAB27抗原，该表面的抗原可受感染等因素影响使HLAB27分子的数量或结构改变而出现假阴性;同时又由于存在抗体交叉性反应，导致可能出现假阳性。本实验表明流式细胞术快捷、简便、省时且稳定性和重复性皆优于微量细胞毒试验，当根据临床症状、体征及X线检查怀疑为AS时， 外周血T淋巴细胞HLAB27可作为早期诊断及支持临床的重要指标。

参考文献

　　［1］　Van Dev LS， Can Der HD. Ankylosing spondylitis［J］.Clinical features，Rheum Dis Clin North Am ， 1998， 24 (4) : 663.

　　［2］　Sartor RB. Colitis in HLAB27/beta 2 microglobulin transgenic rats［J］. Int Rev Immunol ， 2000 ，19(1) :39250.

　　［3］　Dunky A ，Neumuller J ，Hubner C ，et al. HLAB27 determination using serological methods. A comparison of enzyme and a microlymphocytotoxic test with flow cytometry and molecular biological assay［J］.Rheumatol Int ，1996 ，16 (3) :95295.