关于牛磺酸对oxLDL诱导的MC细胞Lox1表达的影响

　　　　　　　　　　 作者：陈海燕 宓宝斌 刘肖林

【摘要】 目的 观察牛磺酸对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导的大鼠系膜细胞（MC）血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1 (Lox1)的表达。方法 培养大鼠MC细胞，分为空白对照组、oxLDL组、牛磺酸组和牛磺酸+oxLDL组，24 h后以RTPCR检测Lox1 mRNA表达情况，并用分光光度比色法测定细胞上清液中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。结果 MC细胞中有Lox1表达，oxLDL诱导后表达增加，并导致MC细胞SOD活性下降、MDA含量明显高于对照组［分别为SOD（19950±0079）×103 U/L， MDA（1250±0002）μmol/L， P＜005］。牛磺酸可明显降低ox LDL诱导引起Lox1表达水平， 同时也使SOD活性增加和MDA含量降低， P＜005。结论 牛磺酸可能通过抑制oxLDL受体Lox1的表达及由其引起的氧化应激减轻oxLDL对肾脏的损伤。
【关键词】 牛磺酸；氧化低密度脂蛋白；系膜细胞
　　【Abstract】 Objective To study the effect on the expression of lectinlike oxidized LDL receptor (LOX)1 induced by oxLDL and the antioxidation of taurine in rat mesangial cells(MC). Methods Four groups were pided in this study：control group， oxLDL group， taurine group， taurine and oxLDL group. Rat MC were cultured for 24 hours and then determined on the expression of Lox1mRNA by RTPCR， the activity of SOD and concentration of MDA in supernate fluid were determined by chromatometry. Results MC did have Lox1 and the expression was higher induced by oxLDL， at the same time the activation of SOD was decreased and the concentration of MDA was increased. Taurine can decrease the expression of Lox1 induced by oxLDL， increase the activity of SOD and decrease the concentration of MDA. Conclusion Taurine can protect kidney from damage probably by inhibiting the expression of Lox1 and oxidative stress induced by oxLDL.
　　【Key words】 taurine，oxLDL，mesangial cell　　
　　
　　牛磺酸(taurine)即2氨基乙磺酸，是体内分布广泛、效应多样的自调素，它不但参与维持机体内环境稳定，而且对多种组织细胞有明显保护作用［１，２］。但其对肾脏系膜细胞是否有直接保护作用，国内外研究报道尚少。有研究表明，氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein， oxLDL)在肾脏病变的发展中起重要作用，而血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1 (Lox1)是近年来发现的oxLDL主要受体。因此，本研究观察牛磺酸对oxLDL诱导的系膜细胞Lox1表达及其抗氧化作用，初步探讨了其拮抗肾脏病变发生发展的可能作用机制。
　　1 材料与方法
　　1．1 试剂 牛磺酸、HEPES购自美国Sigma公司；oxLDL购自中国协和医科大学基础生化所；SOD、MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所；低糖DMEM购自Gibsco公司；胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；RNA抽提试剂盒购自Promega公司；RT PCR试剂盒购自宝生生物工程大连有限公司；7225型紫外分光光度计为上海精密科学仪器有限公司生产；图像扫描仪为Fujifilm公司Image Master VDS产品。
　　1．2 细胞系 大鼠系膜细胞购自杭州市中医院肾病中心。细胞系用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养。
　　1．3 方法
　　1．3．1 细胞培养及分组：大鼠系膜细胞在含10％胎牛血清及HEPES的低糖DMEM培养液中贴壁生长。以每孔5×104个细胞总数接种到24孔培养板，待细胞达到80％左右，更换无血清培养基使细胞同步生长，将培养细胞随机分为4组：①正常对照组，只加无血清培养液；②oxLDL组，无血清培养液加oxLDL，浓度为50 mg/L；③牛磺酸组，无血清培养液加牛磺酸，浓度为20 mmol/L；④牛磺酸+oxLDL组，无血清培养液中含终浓度为20 mmol/L牛磺酸和50 mg/L oxLDL。每组设6个复孔，用药后继续培养24 h，收集细胞上清液和细胞待检。
　　1．3．2 RTPCR检测细胞Lox1 mRNA表达：以Trizol试剂抽提细胞的总RNA，使用逆转录试剂盒，以oligo DT为引物，取总RNA 2 μg进行逆转录反应，之后以50 μl反应体系进行体外PCR扩增，以βactin作为内参。Lox1引物序列为：正义5’GACTGGATCTGGCATAAAGA3’，反义5’CCTTCTTCTTCTGACATATGCTG3’，扩增产物大小为328 bp；βactin引物序列为：正义5’TTCCAGCCTTCCTTCCTGG3’，反义5’TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT3’，扩增产物大小为206 bp，引物均由上海生物工程公司合成。反应条件：预变性94 ℃ 1 min；然后进入94 ℃变性30 s；55℃退火45 s；72 ℃延伸1 min，共35个循环；反应结束前72℃ 10 min以充分延伸。PCR产物于15％琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统拍照并进行半定量分析，βactin值校正，得出目的条带与内参照条带的光密度比值。
　　1．3．3 细胞上清液SOD、MDA水平检测：上述细胞用药后继续培养24 h后收集培养液，2 000 r/min离心10 min，取上清液在分光光度计上测定SOD、MDA，测定均依照试剂盒说明操作。
　　1．4 统计学处理 计量资料以 x±s表示，用SPSS115统计软件进行处理，组间比较用单向方差分析法（Oneway ANOVA）， P＜005表示有统计学意义。
　　2 结果
　　2．1 oxLDL诱导大鼠MC Lox1 mRNA的表达 RTPCR半定量检测表明，大鼠MC在oxLDL刺激下Lox1 mRNA的表达随着oxLDL浓度增加而增强，在浓度为50 mg/L时表达水平最高（图1）。

　　图1 不同浓度oxLDL对大鼠MC Lox1 mRNA表达的影响　略
　　2．2 牛磺酸对oxLDL诱导的大鼠MC Lox1 mRNA表达的影响 20 mmol/L牛磺酸作用24 h后明显降低了oxLDL诱导的大鼠MC Lox1 mRNA的表达（图2）。

　　图2 牛磺酸对oxLDL诱导的大鼠MC Lox1mRNA表达的影响　略
　　2．3 牛磺酸对oxLDL诱导的大鼠MC培养上清液中SOD活性、MDA含量的影响 20 mmol/L牛磺酸作用24 h后SOD活性增加，同时MDA含量降低（表1）。
　　表1 牛磺酸对oxLDL诱导的大鼠MC培养上清液中SOD活性及MDA含量的影响 ( 略)　　　　　　　　　　　　　　　　
　　3 讨论
　　
　　血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1(Lox1)是近年来发现的oxLDL的主要受体，首先被发现于血管内皮细胞［3］ ，后来发现在巨噬细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和血小板中也有表达。在内皮细胞中的研究表明，oxLDL可通过Lox1诱发内皮细胞ROS显著升高，特别是超氧阴离子和h3O2，激活NFκB，减少NO生成，并可导致内皮细胞凋亡［４］。但是关于Lox1在其它细胞中的作用研究还较少，本研究检测Lox1在系膜细胞中的表达，结果显示Lox1也在系膜细胞上有微弱表达，受到oxLDL诱导后表达明显升高，在一定浓度范围内随oxLDL浓度的增加其表达也逐渐增加，但oxLDL浓度达100 mg/L时Lox1表达又逐渐下降，推测这可能与oxLDL的直接细胞毒性作用有关。该实验结果说明不仅对于内皮细胞而且对于系膜细胞而言，Lox1也是其结合或内吞oxLDL的重要受体。牛磺酸是一种β氨基酸的亚磺酸类似物，被认为是含硫氨基酸的无功能代谢产物。最近的研究显示，牛磺酸具有维持细胞内外渗透压平衡、稳定细胞膜、抗脂质过氧化损伤以及调节内皮舒张因子、内皮素等血管活性物质合成释放的紊乱状态［５］等多种作用，但其确切机制尚未完全明了。本实验研究了牛磺酸对Lox1表达的影响，结果显示，牛磺酸可以显著地降低oxLDL诱导引起的Lox1基因表达水平。研究表明，ox LDL作用于内皮细胞膜引起一系列过氧化链式反应，并产生大量的脂质过氧化物，这些脂质过氧化物不仅直接损伤细胞的DNA，诱导内皮细胞凋亡，而且作为一种重要的信使分子，介导多种细胞信号的转导；另有研究表明，牛磺酸对高血糖引起的血管内皮细胞的脂质过氧化损伤有明显的保护作用［６］。至于牛磺酸对oxLDL所致的系膜细胞损伤，目前尚未见相关报道。本实验观察牛磺酸对ox LDL诱导的系膜细胞自由基产生情况，结果表明，oxLDL可使系膜细胞分泌MDA增多、SOD活性降低，而牛磺酸干预可使系膜细胞MDA含量显著下降、SOD活性增加，证实牛磺酸可抑制自由基产生从而保护系膜细胞，减轻oxLDL对系膜细胞的损伤，进而延缓肾脏病变的发生、发展。
　　
【参考文献】
　　［1］ Huxtable RJ. Physiological action of taurine［Ｓ］. Physiol Rev，1992，72:101.

　　［2］　 Strurman JA. Taurine in development［Ｓ］. Physiol Rev， 1993，73:119.

　　［3］　 Sawamura T， Kume N， Aoyama T， et al. An endothelial receptor for oxidized lowdensity lipoprotein ［Ｊ］. Nature， 1997， 386(6620):7377.

　　［4］ Cominacini L， Pasini AF， Garbin U， et al. Oxidized low density lipoprotein(oxLDL) binding to oxLDL receptor1 in endothelial cells induces the activation of NFκB through an increased production of intracellular reactive oxygen species［Ｊ］. J Biol Chem， 2000， 275(17):1263312638.

　　［5］ Fennessy FM， Moneley DS， Wang JH， et al. Taurine and vitamin C modify monocyte and endothelial dysfunction in young smokers［Ｊ］. Circulation，2003，107(3):410415.

　　［6］ 刘江华，文格波，曹仁贤，等.牛磺酸对高葡萄糖损伤血管内皮细胞的保护作用［Ｊ］.中华糖尿病杂志，2000，18：362364.