关于异丙酚预处理对拟AD模型大鼠学习记忆功能和海马损伤表达的影响

　　　　　　　　　　作者：赵冬梅 李清春 刁汇玲 刘洪付 王利民 黄飞

【摘要】 目的 观察异丙酚预处理对拟AD模型大鼠的学习记忆功能和海马损伤神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFT）和bcl2表达的影响，分析异丙酚的脑保护作用。方法 大鼠海马CA1区微量注射冈田酸（Okadaic acid，OA），建立拟AD大鼠模型。异丙酚预处理组大鼠于拟AD模型制作前30 min，腹腔注射异丙酚100 mg/kg。然后用Morris水迷宫观察大鼠行为学变化，Bielschowsky染色观察NFT及免疫组化方法观察bcl2表达的变化。结果 与对照组大鼠相比，模型组大鼠学习记忆能力显著降低；Bielschowsky染色观察海马CA1区域出现大量NFT的特征性病理变化，免疫组化bcl2表达明显减少（P＜0.05）。与模型组大鼠相比，异丙酚预处理组大鼠学习记忆能力明显提高；海马CA1区NFT明显减少或消失，免疫组化bcl2表达明显增多（P＜0.05）。结论 拟AD模型建立前30 min异丙酚预处理能改善拟AD模型大鼠学习记忆能力，能降低NFT的表达，增高bcl2表达，有明显的脑保护作用。
【关键词】 阿尔茨海默病；异丙酚；冈田酸；学习记忆；神经原纤维缠结；bcl2
　　【Abstract】 Objective To study the effects of propofol pretreatment on learning and memory ability，and to investigate the expression of neurofibrillary tangles(NFT) and bcl2 of hippocampus tissues in Alzheimer’s diseaselike model rats，and to analyze the protective effects of propofol on brain. Methods Okadaic acid (OA) was injected into hippocampal CA1 region of rats in model group and pretreatment group to establish Alzheimer’s diseaselike model. Rats in the pretreatment group were abdominally injected with propofol (100mg/kg) before making ADlike model. The learning and memory abilities of rats were assessed through Morris water maze behavioral test. NFT were the characteristic pathological changes of AD，examined by Bielschowsky stain of hippocampus，and the expressions of bcl2 were examined by immunohistochemistry in hippocampus CA1 region of the rats. Results Compared with control group rats， the abilities of learning and memory decreased. Many NFTs were observed in hippocampal CA1 region. The expression of bcl2 in the CA1 region decreased (P＜0.05). Compared with model rats，the abilities of learning and memory of propofol group rats improved. NFT was reduced in hippocampal CA1 region. The expressions of bcl2 in the CA1 region increased(P＜0.05).Conclusion Treated with propofol at 30 minutes before injecting OA can ameliorate the neurobehavioral score of rat with hippocampus injury，reduce the level of NFT and increase the expression of bcl2 in brain tissues of rats with OA injury，which has significant protective effects on brain.
　　【Key words】 Alzheimer’s disease，propofol，Okadaic acid，learning and memory， neurofibrillary tangles，bcl2
　　阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是老年人中发病率高、危害性大的中枢神经系统退行性疾病。到目前为止，其确切病因和发病机制尚不完全清楚，临床上首先表现为近期记忆力减退，继而表现为持续性智能衰退、失语、判断推理能力丧失以及运动功能障碍。脑药物预处理是通过药物激发或模拟机体自身内源性保护物质而呈现的脑保护作用，药物性预处理具有相对安全、方便、易于控制剂量等优点。异丙酚（propofol）为目前最为常用的静脉全麻药物，因其苯环上的结构与天然的抗氧化剂维生素E相似，因而具有了一定的清除自由基和抑制脂质过氧化作用［1］，一些在体动物实验证实了异丙酚具有脑保护效应［2～5］。本实验利用拟AD大鼠模型，观察了用异丙酚预处理海马组织中NFT及bcl2含量的变化，并结合学习记忆能力的改变，评价异丙酚的脑保护作用。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验动物及分组 3～5个月龄健康雄性SD大鼠36只，体重200～250 g，均购自山东大学实验动物中心。随机分为3组：正常对照组（简称对照组）、拟AD模型组（简称模型组）、异丙酚预处理组(简称异丙酚组)，每组12只，自然条件下饲养，自由饮食，光线湿度适中。
　　1.2 实验试剂和仪器 实验试剂：Okadaic acid（OA）粉剂购自美国sigma公司，临用前溶解于10%二甲亚砜（DMSO），配制成0.4 mmol/L溶液；抗bcl2抗体、DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；静安（异丙酚），北京尤费森尤斯卡比制药有限公司分装（批号UI 152，进口编号h30060427）。主要仪器：研究用生物显微镜（带摄像装置及图像分析系统）为德国Leica公司产品；全自动Morris水迷宫，上海吉量软件科技有限公司；脑立体定位仪DYTⅠ，中国天津生产。
　　1.3 实验方法和步骤
　　1.3.1 拟AD模型制作：模型组、异丙酚组大鼠称重，选择右侧海马为注射靶区，10%水合氯醛腹腔麻醉（300 mg/kg）后，固定于脑立体定位仪上，颅顶皮肤常规消毒，剪去头皮，充分显露颅骨，参照George等［６］的《大鼠脑立体定位图谱》，于前囟后（A）3.6 mm，中线右侧（R）旁开2.4 mm处用直径1 mm的颅骨钻钻一小孔，垂直插入自行设计的十字形管，牙科水泥固定。通过十字形管用微量注射器进行海马CA1区微量注射（深度2.7 mm），模型组、银杏内酯组、联合组大鼠均经纵管缓慢注射0.4 mmol/L的OA 0.5 μl，5 min注射完毕，留针10 min。每隔2 d按同样方法剂量注射1次，共5次。对照组用同样方法注入等体积的对照液10% DMSO。术后大鼠肌注青霉素10万单位预防感染，连续5d。
　　1.3.2 异丙酚腹腔注射：异丙酚预处理组大鼠于拟AD模型制作前30 min，腹腔注射异丙酚100 mg/kg，对照组、拟AD模型组用同样方法腹腔注射生理盐水。
　　1.3.3 大鼠行为学检测：大鼠行Morris水迷宫定向航行实验（place navigation test）和空间探索实验（spatial probe test），Morris水迷宫由周围水池和自动录像、记录系统两部分组成。Morris水迷宫水池直径160 cm，深50 cm，摄像镜头安放于水池中心上方2 m高度。将各象限水池壁中点标为入水点，标记4个象限。站台直径12 cm，高30 cm，固定于第3象限，水池中水面高出站台平面1 cm。水中加入适量黑色素，以肉眼看不见站台为宜，保持水温（25±1）℃。周围环境安静，恒定光源。实验开始前1 d将每只大鼠单独放入未放站台的水池中2 min，使其适应水迷宫环境及学习游泳。实验时将大鼠分别从4个象限的固定入水点放入水池，自动录像系统记录大鼠找到平台的时间和游泳路径。水迷宫实验于海马CA1区首次注射后的第4周开始进行，共7 d。第1～6天进行定向航行试验：每日将大鼠按顺序ⅣⅢⅡⅠ象限从各入水点靠池壁放入水中（鼠头朝向池壁，鼠尾没入水中），记录60 s内大鼠从入水到爬上站台所需时间即逃避潜伏期（以在站台上停留达到或超过10 s为上台，不足10 s不作为上台）。每只大鼠每天训练4次，上下午各2次，每只每次间隔时间15 min，中午间隔2 h。训练过程中，若大鼠60 s内找到站台，让其在站台上停留10 s，若未找到站台，引导大鼠上站台，并停留10 s，潜伏期记为60 s；第7天进行空间探索实验：撤去站台，将大鼠从第1象限入水点放入水池，记录120 s内大鼠在各象限的游泳时间和穿越站台次数，作为评价大鼠学习成绩的指标。
　　1.3.4 灌注取材：水迷宫试验结束后，将各组大鼠经10%水合氯醛（按体重450 mg/kg，腹腔注射）深麻后，快速灌入生理盐水150 ml，然后改用10%中性缓冲甲醛（4℃）150 ml灌注，断头取脑，置10%中性缓冲甲醛中浸泡固定7 d。取海马注射点前后约3 mm厚标本，经脱水、透明、浸蜡及石蜡包埋后行大鼠海马冠状位切片，片厚4 μm。同时观察每只大鼠标本海马注射轨迹，注射深度或位置未达要求者不纳入统计处理。
　　1.3.5 Bielschowsky染色：切片脱蜡至水化，用2 %硝酸银水溶液避光浸染于37℃水浴箱内孵育30 min；10%福尔马林液还原数秒钟至切片呈现黄色为止；用氨银溶液滴染20～40 s，倾去染液，直接用10%福尔马林液再次还原1～2 min，使切片呈棕黄色；用0.2 %氯化金溶液调色2～5 min；5 %硫代硫酸钠水溶液固定3～5 min；然后脱水、透明，中性塑胶封固。
　　1.3.6 免疫组织化学两步法：切片常规脱蜡至水；滴加3%h3O2，以阻断内源性过氧化物酶；热修复抗原：将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液（TBS，pH 6.0）中，微波炉“高火”加热至沸腾3 min，后改为“保温”10 min。冷却后磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2～7.6）洗涤2次；滴加适当稀释的一抗（兔IgG）， 37℃恒温水浴箱孵育30 min，PBS洗涤2 min×2次；滴加通用型IgG抗体（Fab段）HRP多聚体，37℃恒温水浴箱孵育20 min ，PBS洗涤2 min×2次；DAB溶液显色：使用DAB显色试剂盒，取1 ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片；室温显色，镜下控制反应时间，一般5～30 min；蒸馏水洗涤；苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。
　　1.3.7 显微镜观察 采用Leica摄像显微镜观察并照像。NFT可在海马CA1区形成并在轴突和胞体处染色较深并呈拖尾形状，bcl2免疫组化阳性细胞在光镜下可见胞质、胞膜和突起呈棕黄色或棕色。计数每张切片4个随机高倍视野中阳性细胞数后取平均值作为计数结果，每组10张切片计数结果取平均值作为最后结果。
　　1.4 统计学处理 应用SPSS11.5统计分析软件包，数据先进行单因素方差分析，多组之间差异两两比较采用SNK检验进行分析，P＜0.05有统计学意义。统计结果以x±s表示。
　　2 结果
　　2.1 实验动物数量分析 共有36只健康雄性SD大鼠接受实验，顺利接受麻醉、异丙酚预处理、拟AD模型建立、神经行为学评分和海马损伤NFT、bcl2测定的有33只。在接受海马CA1区OA注射和异丙酚预处理时，有2只大鼠死亡、1只出现偏瘫无法进行余下实验，这可能与动物的个体差异不能耐受实验有关。随机取30只作为实验样本，每组10只。海马注射深度或位置未达要求者不纳入统计处理，故剔除不合标准的，在测定海马组织损伤表达的时候，每组选取8只大鼠作为实验样本。
　　2.2 大鼠行为学检测 各组大鼠在Morris水迷宫中定向航行实验结果见表1。对照组及异丙酚预处理组的平均逃避潜伏期均渐缩短，从第1天开始，模型组与对照组比较，平均逃避潜伏期均明显延长（P＜0.05）；异丙酚预处理组与模型组比较，平均逃避潜伏期明显缩短（P＜0.05）。撤去站台后，以在原站台象限（第3象限）的活动时间和穿越站台次数为指标，模型组与对照组比较，第3象限活动时间明显缩短（P＜0.05），穿越站台次数明显减少（P＜0.05）；异丙酚预处理组与模型组比较，第3象限活动时间明显延长（P＜0.05），穿越站台次数明显增多（P＜0.05）（见表2）。在第7天撤去平台之后，对照组、异丙酚预处理组大鼠以绕平台游泳和穿梭游泳方式为主，有少量环池游泳；模型组以穿梭游泳和环池游泳为主，有少量绕平台游泳。结果表明，与对照组相比较，模型组大鼠行为模式发生了改变，异丙酚预处理组的行为模式更接近于对照组。表1 各实验组大鼠定向航行实验中每日平均逃避潜伏期表2 各实验组大鼠空间探索实验第3象限活动注：*与对照组比较，P＜0.05；★与模型组比较，P＜0.05
　　2.3 海马CA1区NFT表达 对照组大鼠海马CA1区神经细胞未见明显改变（图1A）；拟AD模型组大鼠海马CA1区锥体细胞层细胞神经原纤维增粗、粗细不等、排列紊乱，有的密集成团块状，呈编织状遍布细胞质并深入到细胞突起，形成NFT（图1B）。模型组与对照组比较，NFT明显增多（P＜0.05）；异丙酚预处理组同模型组比较，NFT明显减少（P＜0.05）（见表3，图1C）。 表3 各实验组大鼠海马CA1区NFT神经元计数
　　2.4 海马CA1区bcl2的表达 正常对照组大鼠海马CA1区bcl2阳性细胞表达较多，可见胞质、胞膜和突起呈棕黄色或棕色（图2A）；模型组大鼠海马CA1区bcl2阳性细胞表达明显减少（图2B），与正常对照组相比有显著性差异（P＜0.05）；异丙酚预处理组表达增多，与模型组相比有统计学意义（P＜0.05）（见表4，图2C）。 注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，★P＜0.05

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　　众所周知，海马作为边缘系统的重要组成部分，是近期记忆回路的重要结构，是学习记忆的重要解剖基础和神经中枢，在学习、记忆、情绪反应及植物神经功能等方面发挥着重要作用［７］，更因其结构上具有高度的序化板层构筑和神经元相对独立分布等特点而成为最理想的学习记忆的研究模型［８］。许多研究表明，海马与机体衰老、阿尔茨海默病及癫痫发作有着非常密切的关系。由于海马不同区域的功能不尽相同，其中CA1和CA3区在学习、记忆中担负重要作用［９］。海马CA1区发育最晚，但是最早出现老化的部分。故本实验将注射部位定位于海马CA1区。我们评价学习记忆的设备是带摄像装置及分析软件的Morris水迷宫，实验数据不受人为因素的影响，结果更为客观、真实。本实验发现模型组大鼠在注射OA结束后的水迷宫行为学实验从第1天起就出现学习记忆能力下降。模型组海马CA1区GFAP免疫阳性神经元显著增多，银染结果显示模型组海马CA1区出现较多的NFT，这与AD的主要病理变化相吻合。
　　我们通过改进的Bielschowsky染色发现，OA可导致大鼠海马和皮层神经元内产生大量的NFT。异丙酚预处理组海马内NFT数量减少，与拟AD模型组比较差异显著（P＜0.05）。NFT是导致神经元纤维退化的主要原因［10］，目前认为NFT的形成与AD病人的认知功能障碍呈明显的正相关。NFT主要成分是过度磷酸化的tau蛋白和少量微管蛋白。正常tau蛋白是可溶性的，可将营养物质从胞体输送到突触末端，而过度磷酸化的tau蛋白则是不溶解的，扭曲变形的微管蛋白不能正常输送营养物质，导致神经元末端的树突和轴突发生营养不良性萎缩。我们推测异丙酚可能影响tau蛋白的异常磷酸化，减少NFT的形成，从而保证轴浆的正常运输。异丙酚组海马CA1区bcl2阳性细胞表达数量明显增加，表明bcl2在拟AD大鼠学习记忆改善过程中发挥作用。目前研究认为bcl2基因及其蛋白bcl2可以抑制或阻断多种因素引起的细胞凋亡，并认为bcl2抑制细胞凋亡的机制与bcl2能抑制Caspase的基因表达 ［１１］，并具有稳定线粒体外膜，调节线粒体功能，阻止细胞色素C的释放［１２］，降低钙离子从内质网的释放［１３］，以及抑制自由基产生，抗氧化等作用有关。
　　近年来，静脉麻醉维持和诱导药物异丙酚的脑保护效应尤为引人注目，大量动物实验和人体试验都发现异丙酚具有脑保护效应，它有良好的对抗应激性血糖升高作用，同时能保证脑氧供需平衡，通过阻滞或减轻继发性脑损害，改善脑创伤后的神经功能而产生脑保护作用。其脑保护机制可能是：①钙通道阻滞药作用：研究表明，异丙酚可其直接或间接地抑制Ca2+经NMDA受体耦联Ca2+通道和电压依赖性Ca2+通道进入胞内，减少自由基的产生［１４］，通过解除缺血区脑微循环灌注，减少线粒体和内质网钙离子活化产生的细胞损伤。②自由基清除剂作用：异丙酚的活性成分的化学结构和已知的氧自由基清除剂丁羟基甲苯和维生素E一样具有酚羟基结构［１］，可有效地防止甲基（酰）门冬氨酸积聚，与氧自由基反应生成酚基氧自由基，从而抵抗氧自由基的作用。③激活γ氨基丁酸A受体：异丙酚可以增强氟硝基安定与中枢苯二氮艹卓类受体的结合，从而增加开启Cl通道的频率，增强γ氨基丁酸的效应；还可以下调NMDA受体拮抗剂所诱导的cfos基因和HSP70基因在后扣带皮质回的表达，从而阻断NMDA受体拮抗剂所致的神经毒性，减轻后扣带皮质回神经元的组织病理损害［１５］。
　　本实验结果，异丙酚预处理的拟AD模型大鼠，空间学习记忆能力明显改善，海马CA1区少见或未见NFT，bcl2表达增高。表明拟AD模型建立前30 min异丙酚预处理能改善拟AD模型大鼠学习记忆能力，降低NFT的表达，增高bcl2表达，有明显的脑保护作用。

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