乏氧对人舌鳞癌Tca8113细胞HIF1α表达影响的分析

　　　　　　　　　　作者：王霞 王培源 孙善珍 吴淑华 曲迅 张祥盛

【摘要】 目的 初步研究乏氧对人舌鳞癌Tca8113细胞HIF1α表达水平的影响。方法 将处于对数生长期的Tca8113细胞置于1%O2、5%CO2、94%N2混合气体的乏氧培养箱内培养，分别在乏氧培养1/2、1、3、6、12和24 h时取出。每个时间段均设常氧培养对照组（5%CO2、95%O2）。采用RTPCR技术检测不同培养条件下细胞HIF1α mRNA的表达情况。结果 HIF1α的表达在乏氧12 h明显升高并达最高峰，24 h时又下降至常氧水平。每个时间段乏氧组HIF1α的表达均高于其相应的常氧对照组。结论 乏氧影响了人舌鳞癌Tca8113细胞HIF1α基因的表达水平，肿瘤细胞通过上调HIF1α基因的表达适应肿瘤乏氧的微环境，有利于肿瘤的发生与发展。
【关键词】 乏氧；缺氧诱导因子1α；Tca8113
　　【Abstract】 Objective To investigate the effect of hypoxia on HIF1α expression in tongue squamous cancer cell line Tca8113 cells.Methods Tca8113 cells in logarithmic grow phase were cultured in hypoxia(1%O2、5%CO2、94%N2) conditions for 1/2 h，1 h，3 h，6 h，12 h and 24 h，respectively. Expression of HIF1α mRNA were assessed by RT-PCR technique.Results The expression of HIF1α mRNA increased significantly and reached the peack after 12 h of hypoxia，and then decreased to the level of normoxic conditions at 24 h. The expression of HIF1α mRNA in hypoxia was higher than that in normoxic control groups.Conclusion Hypoxia upregulates the expression of HIF1α mRNA，which makes cancer cells to adopt hypoxia in solid tumor，and to promote tumor development.
　　【Key words】 hypoxia，HIF1α，Tca8113
　　乏氧是实质性肿瘤微环境的基本特征之一，同时也是肿瘤发生恶性转化甚至转移的始动因素［１］。乏氧条件下肿瘤细胞发生适应性变化，导致一系列病理生理过程，其中乏氧诱导因子(hypoxia inducible factor 1，HIF1)在其过程中起着重要作用。HIF1是由HIF1α、HIF1β两个亚单位组成的异二聚体，其中HIF1α对氧的依赖性较强，在调节微环境的氧平衡中起重要作用。已有研究表明HIF1α在肺癌、脑肿瘤、乳腺癌等多种肿瘤组织中表达［２］，并调节其生物学行为，但HIF1α在舌癌中的研究鲜见报道。本研究采用RTPCR技术半定量检测人舌鳞癌Tca8113细胞在乏氧培养条件下HIF1αmRNA水平的表达变化，观测乏氧对该基因的影响，为肿瘤的治疗寻找新的治疗靶点。
　　1 材料与方法
　　1.1 主要试剂、仪器与细胞 RPMI 1640(GIBCO)；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；Tca8113人舌鳞癌细胞系（中科院上海细胞库）；乏氧培养箱(HERA cell 150，GERMAN) ；RNA提取试剂盒（Trizol，上海生工）；RTPCR试剂盒（Takara产品）；DL2000 DNA Marker（Takara产品）；PCR仪(Eppendorf，德国)。
　　1.2 细胞培养 人舌鳞癌细胞株Tca8113单层贴壁生长，细胞培养液由RPMI 1640、10%胎牛血清、100 U/ ml 青霉素和100 U/ ml 的链霉素构成。置于5%CO2的37℃培养箱内培养，待细胞进入对数生长期后，更换培养液为无血清培养基，而后进行乏氧培养，即把细胞置于1%O2、5%CO2、94%N2混合气体的乏氧培养箱内培养。分别在乏氧培养1/2、1、3、6、12和24 h时取出。每个时间段均设常氧培养对照组（5%CO2、95%O2）。
　　1.3 细胞总RNA的抽提（Trizol试剂盒） 将在不同含氧状态下培养的细胞，去除培养液后加PBS温柔洗涤3次，加Trizol 500 μl，充分混匀，-20℃过夜。加入200 μl氯仿，剧烈震荡混匀30 s；12 000 r/min室温离心15 min；小心转移上清至RNasefree 1.5 ml离心管里，加入等体积的异丙醇，室温离心；弃上清，加入无水乙醇洗涤两次，室温下使酒精完全挥发；沉淀用30～100 μl DEPCh3O溶解。测定样品在260 nm和280 nm的吸收值进行RNA的纯度和浓度分析。
　　1.4 RTPCR检测 按照Takara逆转录试剂盒的说明，以总RNA为模板，以Oligo（dT）为引物合成cDNA第一条链，反应温度为45℃ 25 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min。HIF1α的引物序列：sense：5’GTCTCGAGATGCAGCCAGAT3’，antisense：5’TCACCAGCATCCA GAAGTTTC3’，片段长度为169 bp（山东大学实验中心提供）。在同一试管中加入5×PCR Buffer 10 μl，Takara Ex TaqTM HS 0.25 μl，Primer 各0.5 μl，灭菌三蒸水加至50 μl，PCR扩增条件为94℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，共34个循环，最后延伸72℃ 7 min。实验中以双蒸水代替cDNA作阴性对照。
　　1.5 1.2%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物 取RTPCR产物6 μl和Takara DL2000 DNA Marker 5 μl电泳，紫外照相。捷达专业数码凝胶成像与分析系统3.3测定不同培养条件下HIF1α条带的光密度均值（OD）。
　　2 结果
　　在不同培养条件下除阴性对照外均显示169 bp条带。实验中常氧对照组在培养12 h以前基因的表达呈稳定状态，12 h以后则呈上升趋势；乏氧条件下HIF1α随培养时间的延长表达增强，在12 h达最高峰，24 h时又下降至常氧水平。每个时间段乏氧组HIF1 α的表达均高于其相应的常氧对照组（图1，2）。

　　3 讨论
　　近来研究发现多数体积大于1 mm3的实质性肿瘤都有相当数量乏氧的瘤细胞，且肿瘤内乏氧是肿瘤发生恶性转化甚至转移的重要因素［１］，因此对乏氧的适应是肿瘤形成和发展过程中的一个关键步骤［3］。舌癌是口腔癌中发病率高且易侵袭、转移、预后差的恶性肿瘤之一，肿瘤内部同样存在着乏氧微环境，影响舌癌的生长、侵袭及其对放化疗的敏感性。

乏氧诱导因子1（Hypoxia inducible factor1，HIF1）是肿瘤细胞适应乏氧而产生的一种核转录因子，由HIF1α和HIF1β两个亚单位组成的异二聚体，其中HIF1α对氧的依赖性较强，在调节机体微环境氧的平衡中起重要作用。常氧下，HIF1α在细胞内表达量维持在较低水平，易于泛素化（ubiquitination）被蛋白酶水解，当细胞氧浓度降低时，HIF1α的转录、翻译水平则呈指数增加。HIF1α需在核内与HIF1β结合成二聚体才能形成有活性的HIF1，并可抵抗蛋白水解。乏氧条件下，肿瘤细胞内许多基因的转录和表达发生变化，对乏氧作出应激反应，这些基因被称为乏氧反应基因（hypoxia response gene，HRG），HRG中受HIF1调控的基因则称为HIF1的靶基因。乏氧条件下HIF1调控如红细胞生成素、VEGF、诱导型一氧化氮合酶等40余种靶基因的表达，这些基因的蛋白产物涉及血管形成、能量代谢、红细胞形成、细胞增殖和存活、血管重塑等，均有利于肿瘤在乏氧条件下的能量代谢和氧输送［4，5］。
　　本实验利用乏氧培养人舌鳞癌细胞株Tca8113，模拟了实质性肿瘤内部的乏氧微环境，通过RTPCR技术半定量测定了不同乏氧时间段HIF1α的表达变化，结果发现HIF1α的表达随乏氧时间的延长表达增强，在12 h达最高峰，24 h时又下降至常氧水平；且每个时间段乏氧组HIF1α的表达均高于其相应的常氧对照组。以前有研究认为乏氧时HIF1α主要在蛋白水平上改变明显，而mRNA水平的变化则不明显［6］。本研究则显示乏氧在基因水平上也影响了HIF1α的表达，使其表达增强，这可能是肿瘤细胞适应乏氧微环境维持其生长和侵袭的重要调控中心，进而通过调控其下游靶基因的表达进一步促进肿瘤的发展。常氧对照组12 h以后表达的升高，可能由于培养液营养的耗损，使瘤细胞处于相对乏氧的微环境，也进一步证明了乏氧上调HIF1α的效应。缺氧、癌基因或抑癌基因改变会通过不同的信号传导途径激活HIF1基因，使其转录、表达增高，导致肿瘤的进一步发生发展，并增强其侵袭及转移能力。因此，阻断HIF1α的表达进而阻止其调节下游基因的调控作用将成为肿瘤治疗的新靶点。已有学者利用HIF1α启动细胞转录的机制，驱动自杀基因高效表达，而有效杀伤癌细胞，抑制了肿瘤的发展［7］。

参考文献

［1］ Carmeliet P， Jain RK. Angiogenesis in cancer and other disease［J］. Nature， 2000， 407: 249257.

［2］ Giatromanolaki A， Harris AL. Tumor hypoxia:hypoxia signaling pathways and hypoxia inducible factor expression in human cancer［J］. Anticancer Res， 2001， 21(6B): 43174324.

［3］Huang GW， Yang LY. The molecular mechanism of malignant conversion induced by hypoxia［J］. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi， 2001， 9: 13001304.

［4］ Lee JW， Bae SH， Jeong JW，et al. Hypoxiainducible factor(HIF1)α: its protein stability and biological functions［J］. Exp Mol Med， 2004， 36(1): 112.

［5］Semenza GL. Targeting HIF1 for cancer therapy ［J］. Nat Rev Cancer， 2003， 3(10): 72132.

［6］Wenger RH， Kvietikova I， Rolfs A， et al. Hypoxiainducible factor1 alpha is regulated at the postmRNA level［J］. Kidney Int， 1997， 51: 560563.

［7］ Koshikawa N， Takenaga K， Tagawa M， et al. Therapeutic efficacy of the suicide gene driven by the promoter of vascular endothelial growth factor gene against hypoxia tumor cells［J］. Cancer Res， 2000，60(11): 29362941.