关于二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌模型的建立及病理学改变

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　　　　　　　　 作者：李笑岩 白咸勇 刘同慎 韩玉贞 刘利德

【摘要】 目的 建立操作简便，与人体肝癌发生发展过程相似的肝癌动物模型。方法 取体重150～200 g雄性Wistar大鼠150只，随机分为实验组和对照组，实验组饲以含二乙基亚硝胺（DEN，80×10-6)饮水，连续12周后改为自由饮水。对照组常规自由饮水。结果 病理学检查证实DEN诱发的肝癌为肝细胞癌，诱癌率为70.6%（36/51），大鼠肝癌癌变过程大致经过肝细胞损伤期、肝细胞增生硬化期和肝细胞癌变期等三个阶段。结论 饲以低剂量DEN诱发大鼠肝癌模型建立成功率高，是一种较理想的研究人体肝癌发生的动物模型。
【关键词】 二乙基亚硝胺；肝细胞癌；大鼠；动物模型
　　【Abstract】 Objective To establish an experimental hepatocellular carcinoma rat model which is convenient and similar to the human hepatocarcinogenesis. Methods one hundred and fifty male Wistar rats， weighing 150 to 200g， were randomly pided into two groups. The experimental group’s drinking water contained 80ppm diethylnitrosamine for 12 continuous weeks. The control drank the routine tablewater. Results 70.6% (36/51) hepatocellular carcinoma were induced by DEN. The procession of hepatocarcinogenesis in this model included three stageshepatic toxic lesion， hepatic proliferation/cirrhosis and hepatic carcinogenesis. Conclusion The successful rate of liver cancer model induced by low dose DEN was high， it is an ideal experimental model for the study of hepatocarcinogenesis.
　　【Key words】 Diethylnitrosamine， hepatocellular carcinoma， rat，animal model
　　肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国常见的恶性肿瘤之一，有“癌王”之称。在从肿瘤免疫学、分子生物学和分子病理学等角度来研究它的发生、发展规律及分子机制时，往往要受到临床标本方面的限制。因此在进行肝癌基础研究时，需要选择一种合适的肝癌动物模型来模拟人体肝癌的病变过程，以弥补临床标本的不足。本文介绍较长时期应用低剂量二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌模型及诱癌进程中的病理学变化。
　　1 材料与方法
　　1.1 药品 二乙基亚硝胺，0.95 g/ml，纯度99.9%，美国Sigma公司产品。
　　1.2 实验动物 清洁级雄性Wistar大鼠150只［动物合格证号：SCXK(鲁)20030004］，体重150～200 g，购自山东大学实验动物中心。所有大鼠分笼饲养，采用标准化光照，自由进食，定期更换垫料，适应环境7 d。全部大鼠按随机数字表法分为实验组（135只）及对照组（15只）。
　　1.3 实验方法 实验组饲以含DEN（80×10-6）饮水，连续12周后改为自由饮水。对照组，常规自由饮水。每天观察动物的精神状态、饮食状况及背毛的变化等一般情况。于实验第4、8、12、16、18、20、22、24、25周，随机抽取模型组动物各10～15只，打开腹腔，大体观察暴露肝脏，记录肝脏的形态、颜色、质地。取肝脏标本，4%多聚甲醛缓冲液固定24 h，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察。对照组于第4、12及24周分别取5只，予以同样处理。
　　2 结果
　　2.1 一般情况 诱癌4周后，实验组Wistar大鼠进食量下降，并逐步出现毛色枯燥、发黄、无光泽，行动迟缓，体重较对照组增长缓慢，有些大鼠体重明显偏低。自诱癌第7周末，实验组大鼠开始出现死亡，共死亡Wistar大鼠24只，特别是第17、18周及21～25周死亡大鼠较多，死亡率为17.78%（24/135）。对照组大鼠均生长良好，未见明显病态表现。
　　2.2 诱癌过程中大鼠肝脏病理学改变
　　2.2.1 对照组大鼠：肝脏肉眼观未见明显异常。光镜下肝组织结构正常，肝细胞排列呈索状，围绕小叶中央静脉呈放射状排列。肝细胞胞浆嗜酸性，核嗜碱性，多为单核，位于细胞中央（见图1）。
　　2.2.2 实验组大鼠：实验组大鼠肝脏病理学改变可大致归纳为3期:①诱癌早期——肝细胞损伤期：第1～8周（n=30）。肝脏未见明显异常表观。光镜下见肝细胞肿胀，表现为弥漫性肝细胞水肿，部分肝细胞呈嗜酸性变（见图2）。肝小叶结构尚完整，小叶内可见灶性坏死伴炎性细胞浸润，同时逐渐出现纤维组织增生及肝细胞再生。②诱癌中期——增生硬化期：第9～16周（n=30）。肝脏表面逐渐粗糙，出现数量不等、大小不一的灰白色近圆形病灶，直径大多在1 mm以下，最大者可达5 mm左右，较弥散分布（见图3）。第16周出现肝硬化表现，部分肝叶有明显的胆汁淤积。光镜下见肝细胞水肿进一步加重，可见不同程度的小泡性脂肪变性。

出现嗜酸性或透明细胞增生灶（见图4），并逐渐形成肝细胞增生结节，结节内细胞异型性较小，对周围组织有压迫现象（见图5）。有2例呈非典型增生结节表现，结节内肝细胞不典型增生明显，结节内细胞偶见核分裂及核仁增生（见图6）。门管区静脉扩张充血，有不同程度的卵圆细胞增生及结缔组织增生，向小叶内延伸，伴随胆管增生，数量增多。第12周起可见典型假小叶形成（见图7）。③诱癌晚期——癌变期：第17～25周（n=51）。肝脏表面布满多个大小不一的灰白色结节，最大者4.5 cm×3 cm×2 cm，切面可见出血和坏死。活体解剖有1例大鼠腹腔内出现血性腹水，诱癌过程中死亡大鼠有两例腹腔内出现血性腹水。1例大网膜出现弥漫性结节，肝脏与之粘连。光镜下见肝癌细胞排列成梁索状和团块状，向周围肝组织浸润，可见不同程度的脂肪变性，部分区域有出血、坏死（见图8）。癌周组织细胞水肿、嗜酸性变、脂肪变性，并有肝细胞增生灶、增生结节及非典型增生结节。组织学类型主要为肝细胞癌，有1例混合细胞癌
　　2.3 诱癌过程中各阶段病变类型及发生率 DEN诱发大鼠肝癌各阶段病变类型及发生率见表1。
　　3 讨论
　　肝癌动物模型的选择是进行肝癌实验研究的重要环节。自20世纪初获得小鼠自发性肝癌模型以来，人们对肝癌动物模型的研究不断深入，逐步建立了动物自发性肝癌模型、诱发性肝癌模型、移植性动物肝癌模型以及转基因动物肝癌模型等。各种肝癌动物模型都有其特点及用途，可根据研究目的选择适宜的肝癌动物模型。
　　诱发性肝癌模型是指用化学、物理或生物的致癌因素作用于动物而形成的肝癌模型。其中，DEN诱发动物肝癌是应用比较广泛的一种诱发性肝癌模型。DEN为国际肿瘤研究中心机构（International agency for research on cancer，IARC）确定的致癌物质，对肿瘤的发生具有启动和促进的双重作用。应用DEN诱发大鼠肝癌模型一般采用每周一次0.25%DEN水溶液灌胃，10 mg/kg体重，剩余6 d饲以0.025%DEN饮水［１］；或者经口咽插管灌喂0.2%DEN溶液，每天1 ml，每周连续灌喂4 d，连续灌喂18周后停药［２］；或者每周5次给予大鼠0.2%DEN（10 mg/kg）灌胃给药等造模方式［３］。但此类方法操作较麻烦，且长期灌胃对大鼠机体有一定的损害，易导致口腔和消化道感染。
　　本研究采用饲以含DEN（80×10-6　）饮水诱发的大鼠肝癌模型，具有以下几个特点：①操作较方便，周期较短，诱癌率高（72.5%）。②致癌性较专一，肝细胞癌所占比例大，占97.3%（37例诱癌成功，仅1例为混合细胞癌，其余全部为肝细胞癌）。③癌变过程中有明显的肝硬化过程，诱癌中期肝硬化发生率为23.3%，癌变期肝癌伴肝硬化为17.6%，这一病理改变与人类肝癌在肝硬化基础上发生有一定的相似之处。④诱癌过程经历了肝细胞损伤再生→增生硬化→癌变三个阶段，接近于人类肝癌的发病特点和过程，弥补了临床标本的不足，是一种较理想的研究人体肝癌发生的动物模型。
【

参考文献

】
［1］ 党双锁，袁利超.肝癌动物模型的研究现状［Ｊ］.世界最新医学信息文摘，2004，3(1): 968970.

［2］ 周峥珍，章宗籍，钱忠义，等.DEN诱发大鼠肝癌模型的实验病理研究［J］.昆明医学院学报， 2005，26(3):1519.

［3］ 程延安，袁利超，党双锁，等.间断小剂量DEN诱发大鼠肝癌模型研究［Ｊ］.肿瘤防治杂志， 2005，12(11):806808.