甲状旁腺激素治疗去势大鼠颅骨缺损的分析

　　　　　　　　 作者：刘云启 刘晓丽 张其红 张卫群

【摘要】 目的 研究间歇性皮下注射甲状旁腺激素（PTH）对去势大鼠骨缺损修复的血钙、磷和PTH变化的影响，为更年期骨质疏松治疗提供实验基础。方法 在建立Wistar大鼠骨质疏松模型的基础上，在颅骨人为制造8 mm的缺损，同期植入大鼠自体骨，将大鼠随机分为对照组、去卵巢组和去卵巢后采用PTH134间断给药组，分别于7 、14 、21 、28和56 d抽取血样，检测血钙、磷浓度及PTH浓度变化。结果 自体骨植入术后，去卵巢未治疗组大鼠血钙明显低于其它两组，而血磷明显升高，PTH治疗组与对照组血钙、磷浓度没有明显差异。PTH活性在去卵巢组表现为明显增高，大于其它两组；而用PTH134治疗组的PTH活性则变化不是很明显，与对照组无统计学差异。结论 骨质疏松状态下，PTH血清活性与血钙的浓度成负相关性，而与血磷的浓度呈正相关性。PTH间断用药有助于去势大鼠血钙浓度的维持。
【关键词】 甲状旁腺激素；骨质疏松；去势大鼠
　　【Abstract】 Objective To investigate the effects of intermittence parathyroid hormone fragment 134 on blood Ca2+， PO43- and PTH concentration in ovariectomized rats (OVX). Methods Twentyfour 6month Wistar rats were pided into 3 groups randomly， sham， OVX and OVX treated by PTH134. The Bone Mineral Density of 6 rats selected randomly were valued and confirmed osteoporosis models. The others with 8mm defect in skull were operated， while autograft was embedded in defects. The 6 OVX rats among them were treated for 56 days with PTH134 (40 μg/(kg·d）， once three days) or vehicle as OVX control group respectively. All of the samples of blood were collected while rats were sacrified. The Ca2+ ， PO43- and PTH concentration were valued.Results After operation， Ca2+ of OVX was lowest among three groups， but PO43- higher. While OVX treated with PTH and sham had no difference. PTH concentration of OVX increased higher than others.Conclusion PTH and Ca2+ concentration reversed，as well as the PTH and PO43- fluctuated with the same trend under osteoporosis.
　　【Key words】 parathyroid hormone， osteoporosis， ovariectomized rats
　　骨替代材料在种植修复中的应用已经很普遍［１］。中老年妇女由于绝境后雌激素水平的降低，导致骨质疏松现象尤为突出［２］，是骨替代材料应用的重要人群之一。在治疗骨质疏松的药物研究中，甲状旁腺激素（PTH）被认为是很有潜力的有效药物［3］。本实验建立去卵巢大鼠模型模拟更年期骨质疏松状态，并认为形成大鼠颅骨缺损，同期植入自体骨修复，采用间断皮下注射PTH134，监测PTH对骨质疏松状态下血Ca2+、PO43-和 PTH浓度变化的情况，为PTH临床应用提供参考。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验动物 选用雌性Wistar大鼠24只， 6月龄，体重200～245 g，购自四川大学实验动物中心。按随机数字表平均分为三组：去双侧卵巢组（OVX），去双侧卵巢加药物治疗组（OVX+PTH）和伪手术对照组（sham）。
　　1.2 骨质疏松模型建立 戊巴比妥钠30 mg/kg体重腹腔麻醉，采用经大鼠双侧腰背部侧切口进入腹腔切除双侧卵巢（经组织学证实），伪手术组切除卵巢附近约1 g脂肪组织。60 d后从两组中各随机抽取6只大鼠测定股骨骨密度。所有大鼠同样条件下喂养，自由进食、进水、食用标准颗粒饲料。术后肌注青霉素20万U/（只·次），每天2次，连续注射3 d。
　　1.3 颅骨缺损制备和自体骨的植入 其余18只大鼠进行颅骨缺损制备，麻醉方式同前。行颅顶纵切口，显露颅骨并剥除部分骨膜，流水降温下用牙科钻制备一直径8 mm全层骨缺损，生理盐水冲洗后植入自体骨，并关闭伤口。分别于术后7、14、21、28 d和56 d收取血样检测Ca2+、PO43-和PTH浓度变化。
　　1.4 PTH134给药 PTH134（Sigma，USA）对其中设计为去卵巢同时给于PTH134治疗组Wistar大鼠，按照40 μg/kg的剂量每天给于肌肉注射。单纯去卵巢组每天给予生理盐水0.2 ml/只，每3天注射一次，在第54天注射最后一次。
　　1.5 观察指标 应用单光子大鼠骨矿测定仪（中国测试技术研究院）测定去卵巢60 d大鼠股骨骨密度值并判断骨质状态；采用OCPC法（邻甲酚络合物和钙离子生成红色络合物），选用北京柏定生物工程公司生产的钙、磷检测试剂盒。将样品放入美国PE公司HTS 7000 plus多孔分析仪中，在570 nm波长读数。通过将原始吸光度减去本底吸光度，再除以标准管OD值，乘以2.5 μmol/ml的标准值，即得到样本的钙含量（μmol/100 ml）。采用Elecsys PTH kit (Roche Diagnostic，USA)，E170A（Roche，Japan）全自动实验分析仪检测血PTH活性变化。
　　1.6 统计学分析 用SPSS12.0 统计软件包进行统计学分析，实验资料各组统计量以均数±标准差（ x±s）表示，方差齐性检验后行成组设计资料的t 检验。
　　2 结果
　　2.1 大鼠股骨骨密度测定结果 去卵巢组（0.415 ±0.021）g/cm2，对照组（0.537±0.006)g/cm2，去卵巢组明显低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.01），说明骨质疏松模型已经建立。
　　2.2 PTH134对血清Ca2+和PO43-水平的影响（见表1，2） PTH134 治疗56 d后，与对照组血清钙、磷值比较，无统计学意义；而安慰剂组则表现出低钙和高磷的变化，与对照组和PTH134治疗组都有明显差别。表1 去势大鼠血Ca2+浓度变化表2 去势大鼠血PO43-浓度变化 注：与对照组比较，★ P＜0.05，△P＜0.01
　　2.3 血清PTH水平的变化 安慰剂组的血PTH水平明显高于对照组和PTH134治疗组，而对照组和PTH134治疗组的血清PTH水平变化不明显，治疗组较对照组轻度增高，但没有统计学意义（表3）。表3 去势大鼠血PTH浓度注：与对照组比较，★P＜0.05，△P＜0.01

转贴于 3 讨论
　　PTH是甲状旁腺细胞合成分泌的一种单链多肽分子，是调节细胞外液钙磷浓度的主要激素，其作用是维持血钙和血磷浓度处于正常水平，其靶器官是肾脏、骨骼和小肠［4］。PTH作用靶细胞膜上的腺苷酸环化酶系统，增加胞浆内的cAMP及焦磷酸（PPi）水平［5，6］。PTH对骨的作用有双重性，持续作用可以引起破骨细胞增殖，活性增加，分泌多种水解酶产生大量的乳酸和柠檬酸等酸性物质，使骨基质和骨盐溶解，释放钙和磷到细胞外液。PTH间断刺激则可以刺激骨细胞分泌胰岛样素样生长因子1（IGF1），从而促进骨胶原和基质的合成，有利于成骨作用［7］。PTH其对血磷的影响是通过促进肾远曲小管对Ca2+的重吸收，降低肾磷排泄阈，并抑制肾脏对磷的重吸收，最终导致血Ca2+升高，血磷降低。从而使血钙、磷比例保持恒定［８］。
　　体内PTH分泌受到血浆Ca2+浓度变化的影响，血Ca2+轻度降低，就可以使甲状旁腺分泌PTH明显增高［８］。本试验结果提示PTH与血浆中的钙磷浓度存在一定的相关性。其中单纯去卵巢组（OVX）中，血Ca2+降低的同时，PO43-和PTH浓度明显升高，大于对照组，有统计学决义。而采用PTH间断给药组，Ca2+、PO43-和PTH浓度变化并不明显，同对照组比较，无统计学意义。说明外源性的间断给药，对维持血浆中的PTH正常浓度有一定的作用。究其机制，可能是通过调节肾脏的磷吸收量，升高血钙，进而抑制内源性的PTH分泌，使PTH活性维持在一个较为恒定的生理水平。本实验通过检测Ca2+、PO43-和PTH浓度变化，可以一定程度的反映出间断皮下注射PTH134对骨质疏松症的疗效的影响机制，对临床应用有一定的指导作用。
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