作者：李红蕾 陈晓光 张富春 马纪 徐存拴
【摘要】 目的：在基因转录水平了解细胞骨架相关基因在大鼠肝再生中的作用. 方法： 采用搜集网站资料和查阅相关论文等方法获得上述基因，用Rat Genome 230 2.0 芯片检测它们在大鼠再生肝中的表达情况，用真、假手术比较方法确定肝再生相关基因. 结果： 初步证实249个参与细胞骨架结构和功能的基因与肝再生相关. 其中，肝再生启动［部分肝切除（PH）后0.5~4 h］、G0/G1过渡（PH后4~6 h）、细胞增殖（PH后6~66 h）、细胞分化和组织结构功能重建（PH后72~168 h）等4个阶段起始表达的基因数为107， 29， 137和5，基因总表达的次数为209， 113， 1063和326. 表明相关基因主要在肝再生启动阶段起始表达，在不同阶段发挥作用. 它们表达的相似性分为均上调、上调占优势、均下调、下调占优势、上调和下调相近等5类，涉及107， 37， 67， 28和10个基因，它们共上调1118次，下调480次，分为40种表达模式. 表明肝再生中细胞生理生化活动具有阶段性、多样性和复杂性. 结论： 肝再生早期和前期微丝形成相关基因表达增强，早期、前期和后期微管形成相关基因表达增强，早期、中期和后期中间纤维形成相关基因表达增强，前期核纤层形成相关基因表达增强.
【关键词】 部分肝切除；大鼠；Genome 230 2.0芯片；细胞骨架；基因；肝再生
0引言
肝脏有重要功能和再生能力. 部分肝切除（partial hepatectomy， PH）后，残肝细胞迅速进入细胞周期循环以补偿丢失的肝组织，该过程称为肝再生（liver regeneration， LR）［1］. 通常，根据细胞的生理活动将肝再生分为启动（PH后0.5~4 h）、G0/G1过渡（PH后4~6 h）、细胞增殖（PH后6~66 h）、细胞分化和组织结构功能重建（PH后72~168 h）等4个阶段. 根据时间进程分为早期（PH后0.5~4 h）、前期（PH后6~12 h）、中期（PH后16~66 h）和后期（PH后72~168 h）等4个时期，涉及细胞激活、去分化、增殖及调控、再分化、组织结构和功能重建等生理生化过程. 研究表明，细胞骨架在维持细胞形态、运动、基因表达、信息传递以及能量转换等方面具有重要作用. 通常根据纤维粗细和结构将细胞骨架分为微丝(5~6 nm)、微管(20~25 nm)、中间纤维(7~11 nm)和核纤层. 微丝又称肌动蛋白纤维，由球形亚基装配成的α螺旋纤维组成. 肌细胞中肌动蛋白成束排列构成肌原纤维， 具有收缩功能［2］. 在非肌细胞中微丝是一种动态结构，以不同的结构形式来适应细胞活动的需要. 微管是α和β微管蛋白亚基二聚体组装成的中空管状结构，呈网状和束状分布，并能与其他蛋白共同组装成纺锤体、基粒、中心粒、纤毛、鞭毛、轴突、神经管等结构，在维持细胞形态、运输、染色体运动等活动中起重要作用［3］. 中间纤维是α螺旋杆状蛋白装配成的坚韧纤维，在维持细胞形态、微管装配和稳定中起重要作用，亦与细胞分化密切相关. 在结构上核纤层与中间纤维有密切联系，核纤层与细胞核形态、结构和功能维持密切相关. 为在基因转录水平了解参与大鼠细胞骨架结构和功能的基因在肝再生中的作用，我们用含485个细胞骨架相关基因的Rat Genome 230 2.0芯片检测了大鼠2/3肝切除后基因表达情况，发现其中249个基因与肝再生相关［4］，在此基础上，进一步分析了它们在肝再生中表达动态、模式和作用.
1材料和方法
1.1材料实验用SD纯系大鼠由河南师范大学实验动物中心提供，体质量200~250 g. 将264只大鼠随机分组，每组6只. 其中，22组施行部分肝切除，22组行假手术. 部分肝切除组用外科手术方法切除大鼠左叶肝和中叶肝，并于0.5， 1， 2， 4， 6， 8， 12， 16， 18， 24， 30， 36， 42， 48， 54， 60， 66， 72， 96， 120， 144和168 h的相应恢复时间颈椎脱臼处死动物，接着切取右叶肝置4℃ PBS中涮洗3次，然后从其中部取肝组织100~200 mg，将同组的6只大鼠肝样混合［总肝量为(0.1~0.2 g)×6=0.6~1.2 g］，于-80℃保存备用. 对照组材料为成年大鼠肝，取材方法同部分肝切除组. 假手术组除不切除肝叶外，其他同部分肝切除组. 实验中严格遵循中国动物保护法.
1.2方法
1.2.1总RNA提取与纯化总RNA提取按Invitrogen公司的Trizol试剂盒操作指南进行. 总RNA纯化按Qiagen公司的RNeasy Mini试剂盒操作指南进行. 在260/280 nm波长下测定总RNA浓度和纯度. 用琼脂糖凝胶电泳（180 V， 0.5 h）检测总RNA质量，实验用样品总RNA的28 S和18 S亮度比例约为2∶1.
1.2.2cDNA， cDNA的合成与纯化以T7(dT)24 Primer作引物，取5 μg总RNA作模板，通过SuperScript II RT反转录系统合成cDNA第1条链，按Affymetrix cDNA单链合成试剂盒操作指南合成cDNA第2条链. 按cDNA纯化指南纯化cDNA. 用上述纯化的cDNA 12 μL作为模板，按GeneChip IVT标记试剂盒操作指南合成生物素标记的cRNA，最后按cRNA纯化指南纯化cRNA. 两者的浓度、纯度和质量检测方法同上.
1.2.3cDNA片断化与芯片检测在1 g/L的cRNA溶液15 μL中加入5×片断化缓冲液6 μL和无RNA酶水9 μL混匀，94℃温浴35 min，得到长度为35~200 bp的cRNA片断. 按Affymetrix公司提供的配方配制杂交液，将经过预杂交处理的Rat Genome 230 2.0芯片放入杂交液中，于45℃，60 r/min条件下杂交16 h，然后吸去杂交液，在GeneChip全自动洗涤工作站450(Affymetrix公司，USA)中洗涤和染色芯片. 用高分辨芯片扫描仪3000(Affymetrix公司，USA)扫描芯片获得扫描图像［4］.
1.2.4芯片检测结果分析用Affymetrix GCOS 1.4软件将上述扫描图像转化为信号值. 根据探针信号值的P值确定基因表达（P&<0.05）、临界表达（0.050.065）. 然后分别对每张芯片的信号值做均一化处理，用实验组的均一化与对照组的均一化比值得出某一基因是否发生表达变化，当比值≥2倍时，视为基因表达上调，当比值≤0.5倍时，视为基因表达下调［4］. 为减少芯片分析误差，每个时点的再生肝均用Rat Genome 230 2.0芯片重复检测3次，将3次检测的平均值视为矫正值使用. 最后用GeneMath， GeneSpring和Microsoft Excel等分析软件对各组数据进行统计和聚类分析［4］.
1.2.5肝再生相关基因的确认 根据Geneontology (www.geneontology.org)网站的生物活动分类，将微丝、微管、中间纤维和核纤层分别输入Ncbi (www.ncbi.nlm.nih.gov）和Rgd(rgd.mcw.edu）等网站查找大鼠、小鼠和人的相关基因，并根据Genmapp (www.genmapp.org）、Kegg (www.genome.jp/kegg/pathway.html#amino）和Biocarta(www.biocarta.com/genes/index.asp)等网站的途径图汇总上述基因. 然后查阅相关文献资料对上述基因进行再确认. 除大鼠基因外，将现在认为只存在于人和/或小鼠、在大鼠肝再生发生中有意义、表达变化的基因视为大鼠同源基因. 最后把三次检验结果相同或相似、至少在部分肝切除后一个时点表达上调或下调两倍以上、部分肝切除组与假手术组差异显著（0.01≤P&<0.05）或极显著（P≤0.01）的大鼠基因和大鼠同源基因视为肝再生相关基因.
2结果
2.1细胞骨架相关基因在肝再生中的表达查Ncbi， Genmapp， Kegg， Biocarta和Rgd等网站表明，参与细胞骨架的基因数为840个；查Rat Genome 230 2.0芯片资料表明，该芯片含上述的485个基因. 其中249个基因至少在PH后一个时点发生了有意义表达变化，并且部分肝切除组与假手术组有显著或极显著差异，3次Rat Genome 230 2.0芯片检测结果具有可重复性. 因此，初步确认这些基因与肝再生 (liver regeneration， LR) 相关. 其中，参与细胞骨架的107个基因在肝再生中表达上调，67个基因表达下调，75个基因在有的时点表达上调，有的时点表达下调（简称上/下调表达）. 它们的上调范围为对照的2~180倍，下调范围为对照的2~20倍. 肝再生中基因起始表达的总体情况是：144个基因起始上调，105个基因起始下调. 其中，在启动阶段（PH后0.5~4 h）60个基因起始上调，27个基因起始下调；G0/G1过渡阶段（PH后4~6 h）18个基因起始上调，11个基因起始下调；细胞增殖阶段（PH后6~66 h）82个基因起始上调，55个基因起始下调；细胞分化和组织结构功能重建阶段（PH后72~168 h）2个基因起始上调，3个基因起始下调. 肝再生中基因表达的总体情况是：共表达上调1118次，下调480次. 其中，肝再生启动阶段（PH后0.5~4 h）基因上调149次、下调60次；G0/G1过渡阶段（PH后4~6 h）基因上调91次、下调22次；细胞增殖阶段（PH后6~66 h）基因上调758次、下调305次；细胞分化和组织结构功能重建阶段（PH后72~168 h）基因上调211次、下调115次（图1）. 基因表达贯穿于整个肝再生. 其中，在0.5，2，6~36，42和60 h起始表达上调基因占优势，在1和48 h起始表达下调基因占优势，其他时点只有极少数基因起始表达.
2.2细胞骨架相关基因在肝再生中表达的相似性和时间相关性根据肝再生中基因表达相似性将上述249个基因分为均上调，上调占优势，均下调，下调占优势，上调和下调相近5类，涉及107， 37， 67， 28和10个基因（图2上方树）. 根据肝再生中基因表达的时间相关性将上述基因分为0.5 h， 1和120 h， 2~12 h， 16 h，18和48 h， 24和36 h， 30和42 h， 54和60 h， 66和72 h， 96 h， 144和168 h等13组，表达上调和下调的基因数分别为29和8；87和59；38和11；91和22；82和21；55和18；143和74；135和76；82和36；140和50；127和40；42和24；67和41（图2右侧树）. 上调表达基因主要为促进细胞骨架形成基因. 下调表达基因主要为抑制细胞骨架形成基因.
非点状柱示起始表达基因；点状柱示总表达基因；灰底柱示表达上调基因；白底柱示表达下调基因.
图1细胞骨架249个相关基因在肝再生各时点起始表达及总表达
用Hclustering软件分析Rat Genome 230 2.0芯片检测资料. 红色示表达上调基因. 主要为促进细胞骨架形成基因；绿色示表达下调基因. 主要为抑制细胞骨架形成基因；黑色示未发生有意义表达变化基因. 上方树为表达相似性聚类，分为5组；右侧树为时间相关性聚类，分为13组.
图2细胞骨架相关基因249个在肝再生中表达的相似性聚类和时间相关性聚类
2.3细胞骨架相关基因在肝再生中表达模式根据表达动态将上述249个基因在肝再生中的表达模式分为40类（图3）. 其中，(1)一个时点上调，发生在大鼠部分肝切除后6，24，42，54，60或96 h，涉及8个基因；(2)两个时点上调，在16和42 h，16和96 h，18和48 h，24和48 h，30和42 h，36和66 h，42和96 h，48和66 h，涉及12个基因；(3)三个时点上调，涉及7个基因；(4)多个时点上调，涉及5个基因；(5)一个时段上调，在6~8 h，16~96 h，120~168 h，涉及3个基因；(6)两个时段上调，在8~24和48~66 h，18~24和36~72 h，18~36和48~60 h，涉及3个基因；(7)多个时段上调，涉及2个基因；(8)一个时点/一个时段上调，在6和54~60 h，30和54~60 h，66和2~8 h，66和16~24 h，72和42~60 h，120和18~72 h，涉及7个基因；(9)一个时点/两个时段上调，涉及14个基因；(10)一个时点/三个时段上调，涉及4个基因；(11)一个时点/多个时段上调，涉及4个基因；(12)两个时点/一个时段上调，涉及8个基因；(13)两个时点/两个时段上调，涉及4个基因；(14)两个时点/三个时段上调，涉及5个基因；(15)三个时点/一个时段上调，涉及7个基因；(16)三个时点/两个时段上调，涉及6个基因；(17)三个时点/三个时段上调，涉及2个基因；(18)多个时点/一个时段上调，涉及4个基因；(19)多个时点/两个时段上调，涉及2个基因；(20)一个时点下调，在0.5， 2， 4， 6， 8， 16， 18， 24， 30， 36， 42， 48， 54， 60， 96或144 h，涉及24个基因；(21)两个时点下调，在1和18 h， 2和8 h， 6和96 h， 12和30 h， 16和30 h， 16和42 h， 18和36 h， 18和120 h， 24和36 h， 24和54 h， 30和96 h， 42和60 h， 120和168 h，涉及15个基因；(22)三个时点下调，涉及6个基因；(23)多个时点下调，涉及1个基因；(24)一个时段下调，在6~12 h， 54~60 h，涉及2个基因；(25)两个时段下调，在16~48和60~120 h，涉及1个基因；(26)三个时段下调，涉及1个基因；(27)一个时点/一个时段下调，在30和6~12 h， 96和16~24 h，120和18~24 h，涉及3个基因；(28)一个时点/两个时段下调，涉及1个基因；(29)一个时点/三个时段下调，涉及1个基因；(30)两个时点/一个时段下调，涉及1个基因；(31)两个时点/两个时段下调，涉及2个基因；(32)两个时点/三个时段下调，涉及1个基因；(33)三个时点/一个时段下调，涉及4个基因；(34)三个时点/多个时段下调，涉及1个基因；(35)多个时点/一个时段下调，涉及1个基因；(36)多个时点/两个时段下调，涉及1个基因；(37)多个时点/三个时段下调，涉及1个基因；(38)上/下调混合表达中上调占优势，涉及37个基因；(39)上/下调混合表达中下调占优势，涉及28个基因；(40)上/下调混合表达中上调和下调基因相近，涉及10个基因.
图3细胞骨架相关基因249个在肝再生中表达模式
3讨论
细胞骨架在维持细胞形态、运动、基因表达、信息传递以及能量转换等方面有重要作用. 其中，微丝是重要的骨架成分，以不同的结构形式适应细胞活动的需要. Shimizu等［5］研究表明，抑制肌动蛋白丝形成的ang1在PH后96 h表达上调，本研究亦表明，ang1在PH后上调，30 h达到高峰，是对照的58倍，推测它在再生肝的肌动蛋白丝形成中起关键作用. 促进细胞质动力蛋白复合体形成的dnah11在肝再生早期、dnah7在前期、促进轴丝动力蛋白复合体形成的dnah7和dnah11在前期、促进肌动球蛋白形成的lmo7在中期、dbn1和cnn1几乎在整个肝再生、促进肌动蛋白相关蛋白复合体形成的arpc4几乎在整个肝再生表达上调，推测上述时期相应微丝形成增强. 抑制肌球蛋白形成的lmod1和dusp6在早期和中期、tnni1［6］和trpm7［7］在前期、ppp2cb、ppp6c和myh11在中期、抑制皮层肌动蛋白骨架形成的cfl1在中期、抑制应力纤维形成的mrip在中期和后期、抑制肌丝形成的tpm2在中期、tnni1在后期表达上调，推测上述时期相应微丝形成减少. 促进F肌动蛋白成帽蛋白形成的capza3在中期表达上调，在早期和后期表达下调，抑制F肌动蛋白成帽蛋白形成的cpb1在早期、前期和后期表达上调，推测肝再生中期该蛋白表达增强，早期、前期和后期表达减少. 其中，cpb1在肝再生的1~12， 24， 36， 66， 144~168 h表达上调，36 h达到高峰，是对照的45倍，推测在再生肝的F肌动蛋白成帽蛋白形成中起关键作用.
微管在维持细胞形态、运输、染色体运动等方面起重要作用［3］. 本研究表明，促进管蛋白形成的ttll1和tubb2在肝再生早期表达下调，相反，抑制管蛋白形成的brca1在早期表达上调，促进微管形成的clasp2［9］，rsn和tubg1在后期上调，推测肝再生早期微管形成减少，后期增加. 促进纺锤体形成的prc1，kntc1和spag5在前期表达上调，其中，prc1在肝再生的1， 8， 18~24， 36， 48~72， 120 h表达上调，66 h达到高峰，是对照的26倍，表明它在再生肝的纺锤体形成中起关键作用. 中间纤维在维持细胞形态、微管装配和稳定中起重要作用，亦与细胞分化密切相关. 本研究表明，促进结蛋白纤维形成的vim和促进神经纤丝形成的btg2在前期表达上调、促进结蛋白纤维形成的dmd和neb在早期表达下调、抑制神经纤丝形成的hspb1［10］和抑制中间纤维相关蛋白形成的casp8在早期、中期和后期表达上调、抑制波形蛋白形成的casp8和cdc2a在早期、中期和后期表达上调，而pkn1在前期、中期和后期表达上调，推测肝再生不同时期中等纤维成份表达情况不同，相应的中等纤维骨架组成、结构和功能亦不同. 其中，cdc2a在肝再生的0.5~6， 18~24， 36， 48~72， 120~168 h表达上调，66 h达到高峰，是对照的180倍，推测在波形蛋白形成中起关键作用. 核纤层与细胞核形态、结构和功能维持密切相关，本研究表明，促进核纤层形成的fos及其他7个基因在肝再生前期表达上调，fos在PH后0.5 h表达最多，是对照的28倍，推测它在再生肝的核纤层形成中起关键作用. Shimizu等［5］报道促进核纤层形成的pcna在PH后72 h达到表达高峰，而我们发现，pcna在PH后16~96 h表达上调，24 h达到高峰，其原因有待进一步研究.
综上所述，我们从较长时间和较多时点入手，用高通量基因表达谱芯片分析了部分肝切除后大鼠细胞骨架相关基因表达情况. 初步证实，几乎在整个肝再生中肌动球蛋白和肌动蛋白相关蛋白复合体形成相关基因表达增强，波形蛋白形成相关基因表达减少. 然而，从基因→mRNA→蛋白质→功能等受包括蛋白互作在内的多种因素影响，今后我们将进一步用蛋白质芯片、RNA干扰、蛋白互作等技术分析上述结果.
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