关于shRNA介导的RNAi载体构建及对肝癌耐药细胞MDR1基因表达的抑制

　　　　　　　　 作者：秦维超 张有顺 周新 胡礼仪

【摘要】 　　目的： 重组构建抑制多药耐药MDR1基因表达的shRNA真核表达载体，研究其对肝癌耐药细胞MDR1基因表达的抑制作用，以及对P糖蛋白（Pgp）表达和功能的抑制作用. 方法： 根据MDR1基因序列，设计两段21个碱基的MDR1特异性靶序列作为shRNA目标序列（shMDR11，shMDR12），重组构建pshMDR1表达质粒. 采用脂质体介导转染肝癌耐药细胞SMMC7721/R，用MTT法测定细胞对化疗药物阿霉素（ADM）的敏感性，流式细胞仪检测细胞膜表面P糖蛋白（Pgp）表达和细胞内Rhdaming123（Rh123）的潴留. 结果： PCR和DNA测序证实了pshMDR11和pshMDR12重组质粒的成功构建，均能有效地抑制细胞Pgp表达；转染细胞后均能够一定程度地恢复耐药细胞对化疗药物ADM敏感性，Pgp表达水平明显降低，细胞内的Rh123稳态积累量均明显增高；第1条序列更能有效的抑制MDR1基因表达. 结论： 体外完成shRNA RNAi载体的构建，能有效地逆转肝癌耐药细胞MDR1基因过度表达，抑制Pgp介导的多药耐药. 从DNA载体产生的shRNA在肝癌耐药细胞内能诱导RNAi，能够序列特异性地抑制MDR1基因表达.
【关键词】 RNA干扰；抗药性，多药；短发夹RNA；重组，遗传；质粒；基因表达
　　【Abstract】 AIM: To construct a recombinant plasmid generating short hairpin RNA(shRNA) containing multidrug resistance gene MDR1 segment in mammalian cells and to investigate its suppression on MDR1 mRNA and Pglycoprotein(Pgp) expressions in hepatocellular carcinoma cells. METHODS: Based on the design of two fragments of oligonucleotides for shRNA expression which targeted MDR1 gene (shMDR11， shMDR12)， RNAi plasmids (pshMDR1)were constructed and transfected into SMMC7721/R cells by LyoVecTM. Drug sensitivity was measured by MTT assay， Pgp expression and intracellular Rh123 accumulation were determined by flow cytometry(FCM). RESULTS: Recombinant pshMDR1 vectors were identified by PCR and confirmed by sequencing analysis. They could suppress Pgp expression in hepatocellular carcinoma cells. Drug sensitivity was increased significantly after pshRNAMDR1 was transfected in SMMC7721/R cells. The level of Pgp expression was reduced significantly. The intracellular accumulation of Rh123 was increased greatly after pshMDR1 treatment in SMMC7721/R cells. The shMDR11 was more effective in the suppression of MDR1. CONCLUSION: Recombinant pshMDR1 vector can suppress the expressions of MDR1 mRNA and Pgp in SMMC7721/R cells. The inhibitory effect of the shRNA generated from the DNA vector is highly related to the target sites and to the different cell lines.
　　【Keywords】 RNA interference; drug resistance， multiple; short hairpin RNA; recombination， genetic; plasmids; gene expression
　　0　引言
　　肿瘤化疗失败的重要原因之一是肿瘤产生多药耐药（multi drug resistance， MDR）. 多药耐药基因MDR1基因的过度表达是导致肿瘤细胞产生耐药的重要机制［1-2］. RNA干扰（RNAi）是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法，它通过将双链RNA（dsRNA）导入细胞后，在Dicer酶的作用下产生有活性的小干扰RNA（siRNA），使与该段RNA同源的目的mRNA产生特异性降解，从而导致特异基因表达抑制的转录后基因沉默现象［3-4］. 本实验我们运用PGE1载体，构建了含多药耐药基因（MDR1）的短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体，观察其对肝癌耐药细胞株SMMC7721/R的MDR1， P糖蛋白（Pgp）表达的抑制作用.
　　1　材料和方法
　　1.1　材料
　　肝癌细胞株SMMC7721为同济医科大学免疫教研室沈关心教授惠赠，本研究所传代培养. SMMC7721/R细胞由本室用阿霉素对其敏感细胞株诱导成功后冻存. 宿主菌大肠埃希氏菌SCS1， PGE1质粒及PGE1阴性对照质粒（shneg）， TaqDNA聚合酶，T4DNA连接酶和MgCl2均购自Promega公司，限制性内切酶BamHI和XbaI购自MBI公司，低熔点琼脂糖购自Gibco公司，小量质粒提取试剂盒和回收质粒纯化试剂盒均购自上海申能博彩公司. 转染试剂LyoVecTM为InvivoGen公司产品，抗Pgp抗体为NeoMarkers产品，FITC标记的羊抗鼠IgG为KPL产品，罗丹明123（Rh123）和四甲基偶氮唑盐（MTT）为Sigma公司产品.
　　1.2　方法
　　1.2.1　引物的设计针对质粒PGE1序列，利用引物设计软件设计PCR引物序列，Forward：5′CGT CGA TTT TTG TGA TGC TCG TCA G3′，Reverse：5′GAA GCA TTT ATC AGG GTT ATT GTC TCA TG3′. 根据GeneBank中的MDR1 mRNA序列设计MDR1引物1：5′ CAGGAGATAGGCTGGTTTGATGGT3′，引物2：5′ TTAGCTTCCAACCACGT GTAAATC3′，其产物为172 bp；引物和DNA片段由上海生工有限公司合成.
　　1.2.2　重组质粒的构建与鉴定
　　1.2.2.1　shRNA的设计与合成按照shRNA的设计原则［5］，根据GeneBank MDR1基因已知序列，选取2段含21 nt的MDR1特异性靶序列作为shRNA目标序列（shMDR11： GGA GGC CAA CAT ACA TGC CTT；shMDR12： GAT CGC TAC TGA AGC AAT AGA），在GeneBank数据库进行同源序列搜索，以证明其特异性. 合成该目的序列的反向互补序列，中间通过8 nt的回折序列（GAAGCTTG）将此两段序列相连，形成茎环结构，3′端添加5个T，作为RNA聚合酶Ⅲ的终止子，形成62 nt的寡核苷酸正义链.
　　1.2.2.2　pshRNAMDR1重组质粒的构建合成2对62 nt寡核苷酸链，溶解在ddh3O中，终浓度为0.2 g/L. 正义链和互补链的Oligos退火形成双链DNA（dsDNA），分别与经过酶切回收后的PGE1线性载体连接，得到重组质粒，命名为pshRNAMDR11和pshRNAMDR12. 转化感受态细胞，37℃培养过夜筛选，获得阳性转化子菌落.
　　1.2.2.3　重组质粒的鉴定挑选阳性转化菌落扩增，提取质粒. 用PCR方法初步鉴定，同时设计未带插入片段的PGE1质粒作为对照. 扩增条件：94℃变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环后，72℃延伸5 min. 取PCR产物和DNA Marker经50 mol/L的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定. 提取重组质粒，送大连宝生物工程技术服务有限公司进行序列测定.
　　1.2.3　细胞转染培养调整细胞1×1011/L，接种于6孔板，培养： 100 mL/L小牛血清， 37℃， 50 mL/L CO2；待细胞贴壁至80%汇片后，换入无血清RPMI1640培养基，同时分别加入AB混合液（A液： 一定量20 μL的重组质粒稀释于100 μL无血清RPMI 1640中；B液：25 μL脂质体稀释于100 μL无血清RPMI 1640中，混合AB液. ）置室温孵育30 min，培养5 h后加小牛血清终止转染，24 h后换完全培养基，然后培养不同时间备用. 同时设立PGE1阴性对照质粒（shneg）转染组.

　　1.2.4　重组质粒在细胞内表达MTT法检测细胞对ADM药物敏感性，各试验组细胞转染24 h后，取对数生长期细胞（包括试验组，对照组），调整细胞浓度为1×1011/L. 接种于96孔板，加入不同浓度的ADM，置50 mL/L CO2， 37℃培养箱中孵育48 h后. 加入MTT 10 μL（5 g/L），继续培养4 h后弃培养上清液，加入DMSO，振摇10 min后，570 nm测出吸光度值. 每个浓度组平行4孔，取平均值，计算细胞存活率（90%）＝A实验组/A对照组×100%，以药物浓度为横轴，细胞存活率为纵轴绘制浓度效应曲线，求出回归方程，确定半数抑制浓度（IC50）. 耐药指数（resistance index，RI）= 实验组IC50/亲本细胞IC50.

　　1.2.5　用FCM检测质粒转染后细胞表面膜蛋白Pgp表达各试验组转染细胞72 h后，胰酶消化，调整最终浓度1×1011/L，混匀细胞. 20 g/L甲醛室温固定20 min，冷PBS洗涤2次，加入Pgp抗体，4℃孵育2 h；混匀细胞，PBS洗2次，加入FITC标记的羊抗鼠IgG，室温避光孵育30 min. PBS洗涤后，立即用流式细胞仪检测. 相同处理组平行5孔，以未经处理的SMMC7721/R细胞为空白对照.
　　1.2.6　FCM检测转染后细胞内Rh123的潴留各实验组转染细胞72 h后，用PBS洗2遍. 加入Rh123（0.2 mg/L），37℃培养箱中共孵育45 min. 冷的PBS洗2遍. 胰酶消化各组细胞，调整最终浓度1×109/L，在30 min内用流式细胞仪测细胞内Rh123的强度.
　　统计学处理： 数据均采用x±s表示，运用SPSS12.0统计软件对数据进行单因素方差分析（oneway ANOVA），组间比较利用LSD法检测其差异性，判断标准以P&<0.05为有统计学显著性差异.
　　2　结果
　　2.1　shRNA真核表达载体的构建及鉴定未带插入片段的PGE1质粒扩增产物电泳结果在605 bp处，插入62 nt的pshRNA MDR11和pshRNAMDR12重组质粒的扩增产物在652 bp处，其电泳结果与实验预计的结果完全相符（图1）. 重组质粒的测序结果与设计合成的shMDR1靶向目标序列完全一致，证明把合成的62 nt的寡核苷酸插入到了RNAi载体PGE1中的预计位点，且序列完全一致.
　　2.2　MTT法检测各组细胞药物敏感性SMMC7721/R+shneg与SMMC7721/R细胞组相比较，差异无显著性（P&>0.05）. SMMC7721/R+shMDR11， SMMC7721/R+shMDR12细胞组分别与SMMC7721/R细胞组相比较，IC50明显降低，有显著性差异（P&<0.05）；比较pshMDR11和pshMDR12质粒在细胞内表达同样存在显著性差异（P&<0.05）. 以上表明重组构建的质粒转染细胞后均一定程度地恢复耐药细胞对化疗药物ADM敏感性(表1).表1shRNA对SMMC7721/ADM细胞IC50的影响（略）
　　2.3　Pgp表达水平变化
　　pshMDR11和pshMDR12重组质粒转染MMC7721/R细胞后，细胞膜表达Pgp分别为（45.7±6.3）%和（60.0±4.5）%，与SMMC7721/R细胞（91.3±5.3）%比较，有显著性差异（P&<0.05）；pshMDR11和pshMDR12重组质粒转染细胞后，在细胞内Pgp表达同样存在显著性差异（P&<0.05）. 表明重组构建pshMDR1质粒转染细胞后，在细胞内可以逆转MDR1基因过度表达Pgp，并且两段序列分别所诱导的RNAi效果也具有显著性差异（P&<0.05）.
　　2.4　Pgp功能检测重组质粒转染细胞48 h后，流式细胞仪检测细胞内的Rh123积累量分别为：（73.0±5.2）%， （56.1±3.2）%，未转染SMMC7721/R细胞Rh123积累量为：（24.5±2.6）%；SMMC7721/R+shMDR11，MMC7721/R+shMDR12与SMMC7721/R细胞内的Rh123积累量比较，存在显著差异（P&<0.05）；但与敏感株细胞内的Rh123积累量（98.6±1.2）%相比，其细胞内的Rh123积累量还是相对较低，存在显著差异（P&<0.05）；pshMDR11和pshMDR12质粒转染细胞后，细胞内的Rh123的潴留也有显著性差异（P&<0.05）.
　　3　讨论
　　Pgp是一种ATP依赖跨膜药物外流泵，将细胞内多种MDR相关药物泵出细胞外，导致肿瘤细胞内药物浓度下降而不能杀伤肿瘤细胞，为临床肿瘤化疗失败的主要原因［6］. 因此，研究产生MDR现象的机制及克服MDR现象的方法为提高肿瘤化疗效果的主要途径之一，已成为重要的研究课题. 研究肿瘤细胞MDR的一个重点是耐药性的逆转，已发现多种药物有逆转MDR的作用. 国外近年开始应用反义技术于肿瘤耐药逆转的研究，近来才开始考虑采用RNAi的方法. 本研究就是针对肝癌细胞MDR1基因设计相应的特异序列，连接到带有人U6启动子的质粒DNA载体上（PGE1载体），采用脂质体转染方法，将其导入细胞内，在U6启动子的作用下转录产生shRNA，从而特异地抑制MDR1基因及Pgp的过度表达，使其保持在静寂状态来逆转肿瘤MDR细胞对多种化疗药物的耐受性，恢复对化疗药物的敏感性，达到提高肿瘤化疗效果的目的. 克服化学合成RNA成本高的缺点，采用脂质体转染方法，可克服合成siRNA可能造成的RNase的污染，更利于RNAi技术的推广应用［7］. 如果对克隆重组子结合抗性筛选后，克服瞬时因转染效率不同所带来的基因表达差异，实现了高效抑制，而且能维持较长时间的基因沉默［8］.
　　研究结果表明，pshMDR11和pshMDR12转染SMMC7721/R细胞后，其细胞Pgp表达水平均有明显下降，与SMMC7721/R相比较，具有显著性差异（P&<0.05）；比较pshMDR11和pshMDR12转染组之间细胞Pgp表达，存在显著性差异（P&<0.05）. 表明重组构建pshMDR1质粒转染细胞后，在细胞内可以逆转MDR1基因过度表达，同样设计的两段序列在细胞内产生对MDR1基因的抑制效果具有显著性差异，可以证明shRNA在肝癌耐药细胞内能诱导RNAi，抑制效果与所选目的基因的靶位点高度相关，其机制还有待进一步探讨.
　　Rhl23在Pgp的功能检测中有重要的价值［9］. Rhl23是Pgp较特异的作用底物，可被Pgp泵出细胞外使细胞内Rh123浓度降低，表达MDR1的细胞内Rh123潴留相对较少，通过检测细胞内Rh123浓度能直观地反映其功能. 研究表明，pshMDR1质粒转染细胞后，细胞内Rh123的荧光表达明显升高，分别与未转染组细胞（SMMC7721/R）比较，具有显著性差异（P&<0.05），说明转染pshMDR1后Pgp外排Rh123功能减弱. 进一步表明所构建的pshMDR1真核表达质粒可以抑制MDR1基因过度表达Pgp，使得Pgp表达减少.
　　实验证明：RNA干扰能够特异地抑制MDR1基因的表达，降低耐药细胞表面胯膜蛋白Pgp的表达，从而达到逆转肝癌耐药细胞MDR1，恢复细胞对化疗药物的敏感性，以达到提高肿瘤化疗效果的目的. 研究以特异性shRNA介导的RNAi系统，为逆转MDR1介导肝癌耐药细胞MDR的临床应用提供了实验基础，也为增强肝癌的化疗效果、改善预后带来了希望.