人宫颈癌组织及癌旁正常组织蛋白质组的比较分析

【摘要】 目的: 构建人宫颈癌组织及癌旁组织双向凝胶电泳图谱，筛选差异表达的蛋白质. 方法: 人宫颈癌组织及癌旁正常组织标本10例，应用固相pH梯度双向凝胶电泳后，ImageScanner扫描图像、ImageMaster 2DE Elite4.01软件分析识别差异表达的蛋白质；应用质谱仪得到相应的肽质指纹图谱，联网ExPASY网站查询相关数据库鉴定获得的差异蛋白质点. 结果: 癌组织和癌旁正常组织凝胶的平均蛋白质点数分别为1285±85和1063±76，凝胶上蛋白质点位置上有较好的重复性，不同胶间蛋白质点在等电聚焦方向的偏差是（1.78±0.18） mm，在SDSPAGE方向上的偏差为（1.89±0.21） mm；比较10例宫颈癌组织及癌旁正常组织的双向凝胶电泳图谱，未匹配总点数为156±18，对31个差异蛋白质点进行肽质指纹图分析，初步鉴定了8个与肿瘤基因、细胞周期调控、信号转导等有关的蛋白质. 结论: 建立了分辨率高且重复性较好的人宫颈癌组织与癌旁正常组织的双向凝胶电泳图谱，并成功鉴定出部分与宫颈癌癌变相关的差异表达的蛋白质，为筛选宫颈癌特异性的诊断分子标志物奠定了的基础.
【关键词】 宫颈癌 双向凝胶电泳 基质辅助激光解析电离质谱 蛋白质组
　　0引言
　　宫颈癌（uterine cervical cancer）是妇科常见的恶性肿瘤之一，在非洲和东南亚国家发病率较高. 在我国妇女的各种恶性肿瘤中，子宫颈癌的死亡发生率仅次于乳腺癌［1］. 我们应用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离人宫颈癌组织及癌旁正常组织的总蛋白质，建立双向凝胶电泳图谱，再利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）及数据库搜索对部分差异表达的蛋白质点进行鉴定，为进一步研究差异蛋白质，揭示人宫颈癌发病机制及其诊断、治疗和新药开发等提供理论基础.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　人宫颈癌组织及配对癌旁正常组织（癌周2 cm） 10例取自海南医学院附属医院、海南省人民医院、海南省妇幼保健院的宫颈癌手术切除标本，并经病理检查确诊. 所有标本用生理盐水反复清洗去除血液，并尽可能剪去多余的组织. 处理后的样品用于蛋白质的抽提，或置于-80℃保存待检.
　　1.2方法
　　1.2.1双向凝胶电泳称取50 mg组织样品于液氮下充分研磨至粉末状，用500 μL裂解液充分涡旋混匀，置于37℃孵育1 h，取出后再充分涡旋混匀，4℃离心30 min，吸取上清，应用三氯醋酸沉淀法将其沉淀以去除多糖. 蛋白质纯化后，用Bradford法测定蛋白质的浓度. 等电聚焦按IPGphor等电聚焦系统指南进行. 先定量样品蛋白质和上样，水化和等电聚焦， IPGS平衡，SDSPAGE，参数设置，在20℃下自动进行，总电压时间积为61480 V·h，SDSPAGE按2.5 W/胶条电泳30 min后改为10 W/胶条，直到溴酚蓝到达胶的底线. 等电聚焦结束后，将胶条进行两步平衡，然后将平衡后的胶条移至0. 75 mm厚的12.5 g/L均匀分离胶的上端，进行SDSPAGE电泳. 根据蛋白质银染试剂盒的操作手册及文献对2DE胶进行银染. 凝胶可视化：固定、敏化、银染、显影、终止显影、保存液保存凝胶. 用ImageScanner光密度扫描仪描仪扫描凝胶蛋白质后用获取图像，利用ImageMaster 2D Elite 4.01分析软件对图像进行强度校正、点检测、背景消减、匹配、1D校正、建立平均凝胶等分析.
　　1.2.2质谱分析及蛋白质鉴定随机选取差异较明显的蛋白质点20个，另选取在两块胶上认为匹配的点以及空白胶（溴酚蓝线以外的胶）作为对照，置于ProFlexTMⅢMALDITOF质谱仪分析. 以基质峰和胰蛋白酶自动降解离子峰作为内部标准校正，对肽质量指纹图谱进行校正，获得了肽质量指纹图. 联网至ExPASY网站（www.expasy.org/），应用PeptIdent软件进行查询上述试验获得蛋白质点的肽质指纹数据.
　　统计学处理: 数据以x±s表示，用SPSS10.0软件分析结果.
　　2结果
　　2.1人宫颈癌组织及对应癌旁正常组织的双向凝胶电泳图谱同一标本的总蛋白质选择上样量为0.5 mg，进行3次重复性的检测，发现每次电泳图谱非常相似. Imagescanner扫描仪扫描获取图像后，通过软件对其进行点分析，结果发现宫颈癌组织蛋白质斑点总数为1285±85，癌旁正常组织蛋白质斑点总数为1063±76，大部分蛋白质点主要分布在Mr为30 000～97 000，等电点PI4～6的区域（图1A， B）. 任意选取同一癌组织的3块胶中相互匹配且分辨清晰的20个蛋白质点，选择位置偏于中间的点作为参与的基准点，以参考胶为参考位置，测量出其他两块胶对点在第一向等电聚焦（IEF）及第二向SDSPAGE方向上位置的偏差，发现凝胶的蛋白质点在位置上有较好的重复性，不同凝胶间蛋白质点在IEF方向上的偏差为（1.78±0.18） mm，在SDSPAGE方向上的偏差为（1.89±0.21） mm，获取重复性较好的2DE图谱，有利进一步进行蛋白质组差异分析.
　　2.22DE蛋白质图谱蛋白点匹配分析提取蛋白质并进行2DE，发现蛋白质银染图谱较相似，建立了平均凝胶图谱，并进行点检测. 当同一蛋白质点的表达量在某一类型组织凝胶上较其他类型组织凝胶明显增强（校正后蛋白质点的表达量相差3倍以上），视其为未匹配蛋白质点，经软件分析2DE图谱，结果发现人宫颈癌组织及癌旁正常组织的不匹配的蛋白质点为156±18. 宫颈癌组织凝胶中有85±7个未匹配蛋白质点，其中18为个差异蛋白质点（图1A中标号为1~18的蛋白质点）；癌旁正常组织凝胶中有71±9个未匹配蛋白质点，其中有13个差异蛋白质点（图1B中标号为A~M的蛋白质点）. 差异蛋白质点数18∶13.
　　2.3差异蛋白质点的肽质指纹图分析通过软件分析人宫颈癌组织及癌旁正常组织差异表达的蛋白质，选择差异蛋白质点，经切割、脱色、还原、烷基化、胰蛋白酶酶解、萃取、脱盐后，用MALDITOFMS并以基质峰、酶自动降解片段峰（m/z1993.9772Da）进行校正，测得各自的肽质量指纹图谱（PMF）. 31个差异蛋白质点获得了23张PMF. 进入www.expasy.org界面，应用PeptIdent查询软件在设定查询参数条件下将MALDITOFMS测得各自的肽质量指纹图谱搜索SWISSPROT以及TrEMBL数据库，联合搜索结果及2DE图谱上相应点的表观等电点、分子质量、匹配肽段的多少（4个片段以上）及氨基酸序列覆盖率（＞15％）等进行综合分析. 结果发现人宫颈癌组织凝胶图谱中18个表达差异蛋白质点中，得到12张PMF，有4个蛋白质点得到了鉴定（表1），6个点没有匹配数据库中的任何记录，2个点需进一步分析鉴定. 癌旁正常组织凝胶图谱中13个表达差异蛋白质点中，得到11张PMF，有4个蛋白质点得到了鉴定，3个点需进一步分析鉴定，4个点没有匹配数据库中的任何记录.表1用PeptIdent软件在数据库中搜索到有意义的蛋白质点（略）

　　3讨论
　　目前临床诊断宫颈癌主要依据宫颈细胞学涂片检查， 但其早期诊断阳性率较低. 也有应用SCCAG作为诊断宫颈癌的血清标记物， 但仍有约30%～50%的宫颈癌患者外周血中SCCAG呈阴性. 因此，寻找一种早期诊断宫颈癌的方法极为迫切. 蛋白质组指纹图能够整体定量、动态反应疾病发生过程中蛋白质的种类及其数量峰值变化规律，有助于寻找疾病相关蛋白，成为诊断和判断预后的生物标记及药物治疗的靶点. 近年来，蛋白组指纹图在临床疾病尤其是肿瘤的诊断、预防及治疗方面迅猛发展. 丹麦的一个研究小组［2］利用蛋白质组研究技术分析了150例膀胱癌患者的组织，发现所有的鳞状细胞瘤的尿液中均能发现一种化学诱剂银屑素，推测其极可能作为这种肿瘤的早期标志物. Sarto等［3］在对肾癌的研究中发现有4种蛋白质存在于正常组织而在肾癌细胞中缺如，其中分别为辅酶Q蛋白色素还原酶和线粒体泛醌氧化还原复合物Ⅰ，提示线粒体功能低下可能在肾癌发生过程中起重要作用. 目前关于宫颈癌的蛋白组指纹图方面的研究国内外尚未见报道. 我们应用蛋白质组学技术建立了重复性较好的人癌组织以及配对的正常组织的双向凝胶电泳图谱，比较分析癌组织和正常组织的蛋白质表达谱，并随机选择差异蛋白质点进行了MALDITOFMS分析，建立其肽质量指纹图并对其进行了初步鉴定，获得了8个与肿瘤发生、发展相关的蛋白质，如Rasrelated protein Kab39， Mdm2， nucleolar phosphoprotein B23， CEA等.
　　Rasrelated protein Kab39是Ras基因蛋白家族成员，参与肿瘤的发生发展，在癌组织中的表达水平显著低于癌旁的正常组织，但其机制和意义有待进一步研究［4］. Mdm2在人的多种肿瘤中表达异常，具有转录因子功能，能自发地导致肿瘤发生，通过调节p53的功能，并且能激活cyclin A的启动子而调节细胞周期［5］. Nucleolar phosphoprotein B23是一个位于细胞核的磷蛋白，其功能目前尚不清楚，有研究［6］认为可能与细胞周期中中心粒的复制、Rb蛋白在核仁内的转运、DNA损伤修复等有关. Cytoplasmic dynein heavy chain具有抗细胞凋亡功能，它能与核因子κB（nuclear factorκB，NFκB）的抑制蛋白结合而使其失活而使NFκB信号转导通路激活，该通路与细胞增殖、肿瘤的发生发展密切相关［7］. CEA属于非器官特异性肿瘤相关抗原，分泌CEA的肿瘤大多位于空腔脏器，如胃肠道、呼吸道、泌尿道等. 正常情况下CEA经胃肠道代谢，而肿瘤状态时的CEA则进入血和淋巴循环，引起血清CEA异常增高，使上述各种肿瘤患者的血清CEA均有增高. 有研究表明， CEA在宫颈癌患者组织中表达较癌旁组织明显升高，提示其与肿瘤的发生发展密切相关［8］，但其机制目前尚不清楚.

参考文献

　　［1］姚嘉斐，王彤. 细胞凋亡调节与宫颈癌发生［J］. 中国肿瘤杂志，2002， 29(1)：49-52.

　　［2］Ostergaard M， Rasmussen HH， Nielsen HV， et al. Proteome profiling of bladder squamous cell carcinomas: Identification of markers that define their degree of differentiation ［J］. Cancer Res， 1997， 51(8): 4111-4117.

　　［3］Sarto C， Marocchi A， Sanchez JC， et al. Renal cell carcinoma and normal kidney protein expression ［J］.Electrophoresis 1997， 18(34): 599-604.

　　［4］Pfeifer GP，Yoon II，Liu L，et al. Methylation of the RASSFIA gene in human cancers ［J］. Biol Chem， 2002， 383(6):907-914.

　　［5］Leveillard T，Wasylyk B. The PA DM2 Cterminal region binds to TAF11250 and is required for MDM2 regulation of the cyclin A promoter ［J］. I Biol Chem，1997， 272(49):30651-30661.

　　［6］Mann M，Hendrickson RC，Pandey A. Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry ［J］. Annu Rev Biochem， 2001，70:437-473.

　　［7］Shirota Y，Kaneko S，Honda M，et al. Identification of differentially expressed genes in hepatocellular carcinoma with cDNA microarrays ［J］. Hepatology， 2001， 33(4):832-840.

　　［8］Molina R，Filella X，Lejarcegui JA. Prospective evaluation of squamous cell carcinoma and carcinoembryonic antigen as prognostic factors in patients with cervical cancer ［J］. Tumor Biol， 2003， 24(3): 156-164.