关于P14ARF在宫颈癌及癌前病变中的表达及其与HPV感染的关系

【摘要】 　　目的： 探讨P14ARF，HPVDNA在宫颈癌组织中的表达并分析两者的关系. 方法： 用免疫组化SP法检测正常宫颈组织20例、宫颈上皮内瘤样变组织10例、宫颈癌组织50例中的P14ARF的表达. 用PCR法检测同样标本中HPVDNA表达情况. 结果： P14ARF和HPVDNA在宫颈癌、宫颈上皮内瘤样变组织中的阳性表达率明显高于正常宫颈组织中的表达，差异有统计学意义（P＜0.05）. 在宫颈癌组织中P14ARF阳性表达率与组织学病理分级、肌层浸润深度有关，差异有统计学意义（P＜0.05），其阳性率逐级上升；与临床分期、淋巴结转移无关. HPVDNA的阳性表达率与组织学病理分级、临床分期、肌层浸润深度均无关. P14ARF与HPVDNA的表达呈正相关（r＝0.432， P＝0.002＜0.05）. 结论： P14ARF的异常表达、HPV的持续感染与宫颈癌及癌前病变中的发生、发展密不可分，是宫颈癌新的肿瘤标志物.
【关键词】 宫颈肿瘤；P14ARF；乳头状瘤病毒，人；免疫组织化学；聚合酶链反应
　　【Abstract】AIM: To study the expressions of P14ARF and HPVDNA in cervical carcinoma and their relationship. METHODS: Immunohistochemical SP method was used to detect the expression of P14ARF， in 20 cases of normal cervical tissues， 10 cases of cervical intraepithelial neoplasia(CIN) and 50 cases of cervical carcinoma. PCR technology was used to detect the expression of HPVDNA in the same cases. RESULTS: The positive rates of P14ARF and HPVDNA in cervical carcinoma and CIN were higher than those in normal cervical tissues(P＜0.05)． P14ARF expression was positively correlated with histological grade and muscular invasion(P＜0.05)， but not correlated with surgical stage and lymph node metastasis(P＞0.05). There was no association of HPVDNA expression with histological grade，surgical stage and muscular invasion(P＞0.05); positive correlation was also found between P14ARF and HPVDNA expession(r＝0.432， P＝0.002＜0.05). CONCLUSION: The variation of P14ARF expression and the HPVDNA persistent infection in cervical carcinoma may contribute to the occurrence and development of the cervical carcinoma. P14ARF is regarded as a new marker of cervical neoplasm.
　　【Keywords】 cervix neoplasms; P14ARF; papillomavirus， human; immunohistochemistry; polymerase chain reaction
　　0 引言
　　目前，对于宫颈癌及癌前病变诊断主要采用宫颈细胞学涂片、阴道镜检查和活体组织学检查等方法，但因受工作人员主观因素的影响很难做出准确的诊断. 因此，寻找除了人类乳头瘤病毒（HPV）以外的生物标志物用于宫颈癌及癌前病变的辅助诊断十分重要［1］. 我们采用免疫细胞组化链霉菌抗生物素—过氧化物酶（SP）方法，检测P14ARF基因在不同宫颈病变中的表达状况，以确定其能否作为宫颈癌及癌前病变的生物标志物. 同时采用PCR的方法，检测HPVDNA表达，观察P14ARF在宫颈癌及癌前病变中的表达及其与HPV感染的关系.
　　1 对象和方法
　　1.1 对象
　　标本选自兰州大学第一附属医院妇产科200511/200603间手术切除和放化疗前宫颈活检、经病理确诊的宫颈癌石蜡标本50例，宫颈上皮内瘤样病变（CIN）10例. 患者年龄24～87（中位年龄44）岁；其中，原位癌5例，浸润癌45例；鳞癌46例，腺癌4例. 组织学病理分级为G1级9例，G2级21例，G3级20例. 按FIGO（1985）分期标准：Ⅰ期14例，Ⅱ期26例，Ⅲ期10例；有淋巴结转移者28例，无淋巴结转移者22例；浅肌层浸润者20例，深肌层30例. 另取同期因子宫肌瘤行子宫全切的正常宫颈组织20例作对照. P14ARF兔抗人多克隆抗体、生物素标记的第二抗体及SP免疫组化染色试剂盒（福州迈新生物技术开发公司）. 人乳头瘤病毒（HPV通用型）检测试剂盒（广州中山大学达安基因有限公司）.
　　1.2 方法
　　1.2.1 P14ARF的检测
　　所有标本均经100 mL/L甲醛固定，石蜡包埋，切片厚4μm. 免疫组化染色采用SP法，操作步骤严格按试剂盒说明书进行.
　　1.2.2 HPVDNA提取及扩增石蜡包埋标本切片厚5 μm，5～8片，放入1.5 mL无菌试管内，加入1 mL二甲苯，37℃恒温箱内脱蜡30 min，重复2次；用无水乙醇、无菌生理盐水洗涤. 所有标本采用常规碱裂解法提取HPVDNA，提取加样后反应管置于PCR仪上，先按93℃保温3 min，再按93℃ 45 s→45℃ 45 s→72℃ 60 s，循环35次，最后72℃延伸5 min.
　　1.2.3 结果判断
　　① 免疫组化细胞核或细胞质内出现棕黄色颗粒为p14ARF表达阳性. 按每张切片在40倍显微镜下选定10个视野，每个视野记数100个细胞，并按其染色有无及强弱程度划分为：阳性细胞&<5%或无阳性细胞为阴性(-)；阳性细胞6%~25%为弱阳性(+)；阳性细胞26%~50%为阳性()；阳性细胞&>50%为强阳性(). ② PCR结果判断在PCR扩增后的反应管中加入4 μL上样缓冲液充分混匀后，取15 μL下层蓝色液体，经含EB的20 mL/L琼脂糖凝胶电泳30 min. 将胶置于紫外检测分析仪上观察，与阳性对照处于同一位置者为人类乳头瘤病毒感染.
　　统计学处理： 采用SPSS10.0软件系统，运用R×C表的χ2检验、等级资料的秩和检验(KruskalWallis H和MannWhitney U)，Spearman等级相关分析法.
　　2 结果
　　2.1 P14ARF免疫组化染色在50例宫颈癌组织中，6例表达阴性，44例表达阳性(图1A~C)，其中12例弱阳性，15例阳性，17例强阳性；宫颈腺癌组织中P14ARF呈阳性表达（图1D）；10例CIN患者组织中5例P14ARF呈阳性表达（图1E）， 5例呈阴性. 20例正常宫颈组织中P14ARF仅有2例呈阳性表达，其余均为阴性. P14ARF在正常宫颈组织、CIN、宫颈癌组织中阳性表达率分别为10%，70%，88%，三者比较差异有统计学意义（P＜0.05，表1）. 其阳性表达率随着宫颈癌组织学病理分级的增高、肌层浸润深度的增加而逐渐上升，差异有统计学意义（P＜0.05），与临床分期、淋巴结转移无关（表2）. A：宫颈鳞状细胞癌组织；B：宫颈原位癌组织；C：宫颈早期浸润癌组织；D：宫颈腺癌组织；E： CINⅡ组织.
　　2.2 HPVDNA检测50例宫颈癌组织中，27例HPVDNA检测阳性，23例阴性（图2）. 10例CIN患者组织中5例HPVDNA检测呈阳性，5例阴性. 20例正常宫颈组织中，有2例HPVDNA检测阳性，18例阴性. HPVDNA在正常宫颈组织， CIN， 宫颈癌中阳性表达率分别为10%， 50%， 54%，三者比较差异有统计学意义（P＜0.05，表1）. 其阳性率与组织学病理分级、临床分期、肌层浸润均无关（表2）. 表1P14ARF和HPVDNA在正常宫颈组织，CIN，宫颈癌中的检测阳性表达率（略）表2P14ARF和HPVDNA与宫颈癌分化程度的关系（略）
　　2.3 P14ARF与HPVDNA的相关性
　　经Spearman等级相关分析，P14ARF和HPVDNA在宫颈癌组织中的表达呈正相关（r＝0.432， P＝0.002＜0.05，表3）. 表3P14ARF与HPVDNA在宫颈癌组织中表达的相关性（略）
　　3 讨论
　　P14ARF是新近发现的一个抑癌基因，位于人第9号染色体短臂2区1带(9p21)，编码P14ARF蛋白［2］，其作为一种多效性调节蛋白，作用于人类肿瘤细胞中的2条最主要的细胞周期调控通路：p53通路和Rb通路，监测细胞周期关键卡点蛋白的表达，对监测细胞周期和抑制肿瘤的发生发挥了重要作用［3-5］. 近年来研究表明，癌蛋白MDM2往返于细胞质和胞核之间，当MDM2p53复合物由胞核进入胞质时，p53通过蛋白蛋白酶体(ubiquitinproteasome)通路(UP通路)降解，而MDM2返回胞核，故核质穿梭对于MDM2能够促进p53基因降解是非常重要的. P14ARF作为调控细胞周期网络的重要部分，通过p53通路和非p53通路直接和某些调控因子如E2F，myc等作用，监控细胞周期，从而抑制肿瘤的发生［6］. 当致细胞异常增生的某些致癌刺激因子如myc，ras等的作用诱导P14ARF的高表达时，

其表达的蛋白与MDM2的羧基端作用，加速癌蛋白MDM2的降解，同时P14ARF和p53与MDM2蛋白形成p53MDM2P14ARF三联体复合物和相互调节的反馈环路，将MDM2屏蔽于细胞核内，使MDM2无法将p53输出细胞核并进而偶连泛素，抑制了MDM2介导的p53泛素化酶降解，恢复和稳定了细胞内的p53水平，进而启动凋亡或细胞周期阻制［7］. 研究表明P14ARF基因及其产物在大多数人类原发性肿瘤细胞中均缺失，但与上述观点不同的是，在本实验中P14ARF在大多数宫颈癌及癌前病变中呈高表达. 究其原因，可能与宫颈癌及其癌前病变中高危型HPV持续感染密切相关［8］. 因为高危型HPVE6蛋白可结合p53蛋白，使其失活，通过负反馈机制使P14ARF的表达上调. 另外，HPVE7癌蛋白与pRb蛋白结合，使E2F1从E2F1/pRb复合物中释放出来，而E2F1可诱导P14ARF表达，从而使得P14ARF在宫颈癌中高表达.
　　
　　我们的结果表明，P14ARF和HPVDNA在正常宫颈组织， CIN， 宫颈癌中的表达存在差异有统计学意义（P＜0.05），且在癌组织中P14ARF表达随着组织学病理分级的增高、肌层浸润深度的增加而增加［9］，与临床分期、淋巴结转移无关，这将提示我们P14ARF蛋白的过表达可能是宫颈癌发生的一个特征事件，在由CIN转变成宫颈癌的过程中起着重要的作用. 而在本实验中，我们对于HPVDNA的检测结果显示HPVDNA的表达与组织学病理分级、临床分期、肌层浸润均无关，就其与P14ARF相关性来说，存在正相关r＝0.432，44例P14ARF阳性者中27例 HPV是阳性. 换句话说HPV是P14ARF的增敏物，因为P14ARF只有在高危型HPV致癌基因整合到宿主细胞基因组，并破坏了G1期调节级联才会高表达，也就是说P14ARF表达阳性就意味着细胞已被启动了“癌变”的程序，我们临床工作者就应该提高警惕以预防“癌变”的进展，所以P14ARF作为一个较理想的标志物在宫颈癌发生发展中起着重要的作用. 尽管P14ARF的应用还有许多疑问尚待深入研究，但综合来看，P14ARF作为宫颈癌及其癌前病变的诊断性标志物指导临床工作是很有应用前景的.

参考文献

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