关于人工虫草多糖对免疫低下小鼠免疫功能的影响

【摘要】 目的：以人工虫草多糖作为受试物，观察其对免疫功能低下小鼠免疫功能的影响. 方法：采用碳粒廓清法、二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应试验法及溶血素试验法， 观察人工虫草多糖对免疫功能低下小鼠非特异性和特异性免疫功能的影响. 结果：人工虫草多糖140 mg/kg能显著地增加小鼠碳粒廓清指数K及吞噬指数α， 增强氢化可的松诱导的免疫功能低下小鼠单核巨噬细胞的吞噬功能；在迟发型变态反应实验中， 140 mg/kg，70 mg/kg虫草多糖剂量组能显著地增加小鼠耳肿胀度，提示虫草多糖可增强环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠迟发性变态反应. 140 mg/kg虫草多糖剂量组能显著提高小鼠溶血素水平， 提示虫草多糖可增强环磷酰胺诱导免疫功能低下小鼠的特异性体液免疫功能. 结论：人工虫草多糖对免疫功能低下小鼠非特异性和特异性免疫功能具有一定增强作用.
【关键词】 冬虫夏草 人工虫草多糖 迟发型变态反应 溶血素 碳粒廓清 疫抑制
　　 0 引言
　　冬虫夏草是虫草真菌（Cordyceps sinensis）的子座及其寄主蝙蝠蛾（Hepialus armoricanus）幼虫体的复合物. 冬虫夏草是一种名贵的强壮滋补中药，由于有其严格的寄生性及特殊的生长地理条件，因此产量有限，人工培养虫草菌丝体的成功，大大促进和加快了药理方面的研究. 虫草对免疫及血液系统有调节作用，对心脏损伤有保护和防治作用［1-3］. 我们从人工虫草菌丝体中分离提取有效成分虫草多糖，观察了人工虫草多糖对免疫功能低下小鼠非特异性和特异性免疫功能的影响.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料 ICR小鼠150只，体质量18～22 g，雌雄各半（西安交通大学实验动物室）；人工虫草（华东制药股份有限公司；人工虫草多糖(polysaccharide from cultured Cordyceps sinensis， PCCS)采用水提醇沉法提取多糖，应用苯酚硫酸法测定多糖，含量约为40%; 云芝多糖（polysaccharide from Coriolus versicolor， PCV)购自南京老山制药厂；氢化可的松（上海信谊药厂）；注射用环磷酰胺（Cytoxan， CTX）购自上海华联制药有限公司；印度墨汁（Black Indian Ink）购自北京西中化工厂，使用前用生理盐水稀释3倍， 超声处理后离心， 弃去沉淀物；二硝基氟苯（Dinitrofluorobenzene， DNFB）购自吴江市青云精细化工厂，使用前配成10 g/L溶液， 称取DNFB 50 mg， 溶于预先配好的丙酮麻油溶液(丙酮麻油1∶1) 5 mL中； 羊红细胞（SRCB）购自西安交通大学， 临用前用生理盐水配制成200 mL/L； 都氏试剂: NaHCO3 1.0 g， KFeCN4 0.2 g， KCN 0.05 g， 用蒸馏水溶解至1 L， 均为市售分析纯.
　　1.2 方法
　　1.2.1 对免疫低下小鼠非特异性免疫功能影响-碳粒廓清法［4］ 将ICR小鼠随机分为5组， 每组10只. 即140 mg/kg PCCS，70 mg/kg PCCS剂量组，1 g/kg PCV阳性对照组，模型组和正常对照组（给予等量5 g/L羧甲基纤维素钠溶液）. 上述各组均灌胃给药，除正常对照组外，其余各组皮下注射氢化可的松50 mg/kg，1次/d，连续6 d，造成免疫功能低下模型，同时给予药物，连续7 d. 于末次给药后0.5 h， 于各鼠尾静脉注射经稀释的印度墨汁5 μL/g， 于1(t1)和5(t5) min后， 分别从眼眶静脉取血20 μL，加到1 g/L Na2CO3溶液2 mL中摇匀， 用分光光度计在680 nm处测定t1和t5的吸光度值（A1，A5）， 计算廓清指数K. 之后，将小鼠放血处死，取肝脏及脾脏称质量，计算吞噬指数α. 廓清指数K=(logA1-logA5)/(t5-t1)=log(A1/A5)/4. 吞噬指数α=体质量/肝脾重×K1/3.
　　1.2.2 对环磷酰胺诱导的免疫功能低下小鼠迟发型变态反应的作用［5］ 取小鼠50只，分组及灌药同1.2.1. 将每鼠腹部去毛， 范围为3 cm×3 cm， 将10 g/L DNFB均匀涂抹于上，涂抹当日除正常对照组外各组腹腔注射CTX 50 mg/kg，隔日加强1次. 末次给药后0.5 h，将10 g/L DNFB均匀涂抹于小鼠右耳进行攻击，使局部产生迟发型变态反应（水肿），攻击后24 h，脱颈椎处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器取下直径8 mm的耳片，称质量，以左右耳片重量之差作为肿胀度，比较各组的差别.
　　1.2.3 对环磷酰胺诱导免疫功能低下小鼠的特异性体液免疫功能的作用［6］ ICR小鼠分组及剂量设置同1.2.1，上述各组均灌胃给药， 1次/d， 连续4 d. 给药第1日腹腔注射200 mL/L SRBC 0.2 mL/只，免疫当日除正常对照组外各组肌注CTX 20 mg/kg，连续3 d. 免疫后第4日摘眼球取血，分离血清，将血清稀释500倍后供测定. 反应管内依次加入经稀释的血清1 mL，50 mL/L SRBC 0.5 mL， 100 mL/L补体1 mL， 置于37℃恒温水浴中保温30 min，然后移至冰浴中终止反应，1500 r/min离心5 min，取上清液1 mL加都氏试剂3 mL， 摇匀放置10 min，测A540 nm. 测定SRBC半数溶血值：取50 mL/L SRBC 0.25 mL加都氏试剂至4 mL， 测A540 nm. 计算血清HC50=样品A540 nm/SRBC半数溶血值×稀释倍数.
　　统计学处理: 数值用x±s表示，采用t检验进行统计学分析.
　　2 结果
　　2.1 对免疫功能低下小鼠非特异性免疫功能的作用 140 mg/kg PCCS剂量组能显著提高碳粒廓清指数和吞噬指数的作用， 与模型组比较有统计学差异（P&<0.01， P&<0.05）. 同模型组比较，140 mg/kg PCCS剂量组能显著增加脾指数和胸腺指数（P&<0.05），70 mg/kg PCCS剂量组可显著增加脾指数（P&<0.05， 表1， 2）.表1 虫草多糖对碳粒廓清指数和吞噬指数的影响表2 虫草多糖对脾指数和胸腺指数的影响 aP&<0.05， bP&<0.01 vs模型. PCCS: 人工虫草多糖；PCV: 云芝多糖.
　　2.2 对免疫功能低下小鼠迟发型变态反应的作用 和模型组比较， 140 mg/kg PCCS和70 mg/kg PCCS剂量组能显著增加小鼠耳肿胀度（P&<0.01， P&<0.05），提示PCCS可增强环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠迟发性变态反应（表3）.表3 虫草多糖对免疫功能低下小鼠耳肿胀度及半数溶血值的影响aP&<0.05， bP&<0.01 vs模型. PCCS: 人工虫草多糖；PCV: 云芝多糖.
　　2.3 对免疫功能低下小鼠的特异性体液免疫功能的作用 与模型组比较，140 mg/kg PCCS剂量组能显著增加半数溶血值的作用(P&<0.05). 表明PCCS对CTX诱导降低的特异性体液免疫具有一定的增强作用（表3）.
　　3 讨论
　　单核巨噬细胞系统(网状内皮系统，RES)因能迅速清除多种致病物质， 是维持机体内环境稳定的一个重要系统. 巨噬细胞是免疫细胞的一种， 具有多种免疫功能如吞噬及杀伤多种病原菌微生物、处理和呈递抗原、分泌细胞因子(IL1，IL6，IL8)等， 在炎症和肿瘤等许多疾病过程中发挥了重要的作用. 转贴于 我们观察了PCCS对非特异性免疫的影响，结果表明PCCS可显著提高氢化可的松诱导的免疫功能低下小鼠碳粒廓清指数和吞噬指数，具有增强网状内皮系统功能. 体外实验也显示虫草水提取物可直接激活小鼠腹腔巨噬细胞，提高其吞噬功能. 说明PCCS对非特异性免疫功能具有明显增强作用［7］. PCCS还具有显著增强免疫低下小鼠特异性细胞免疫及体液免疫的作用，应用定量溶血分光光度法检测抗体形成细胞所分泌的抗SRBC抗体，其结果也表明虫草水提物可提高正常及CTX抑制的小鼠体液免疫功能， 可能是直接刺激B淋巴细胞增殖而增强小鼠体液免疫功能所致. 冬虫夏草对细胞免疫有促进作用， 能促使脾脏淋巴细胞增殖， 提高脾脏淋巴细胞E玫瑰花结形成率， 明显拮抗强的松龙及环磷酰胺引起的脾脏淋巴细胞E玫瑰花结形成率的减少［7-9］.
　　人工虫草对免疫功能具有促进和调节作用， 为虫草防治免疫失调/低下及肿瘤等疾病提供了科学依据，其作用机制尚未完全阐明，多数作者认为虫草是一种良好的生物反应调节剂，通过机体的神经体液调节，在提高整体能量与物质代谢基础上进而改善各系统、组织器官的功能，发挥其扶正祛邪的作用. 抗癌作用可能主要是通过增强免疫，抑制肿瘤细胞生长扩散，而促进机体康复［10］. PCCS作为安全有效，无毒副作用的免疫调节剂具有广阔应用前景.

【参考文献】
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