关于D氨基葡萄糖衍生物诱导人结肠癌SW1116细胞凋亡的形态学变化

　　　　　　　　　　 作者：寇炜，吴静，赵晋，兰咏梅，窦春江，王爱勤

【摘要】 　　目的：研究D葡萄糖衍生物2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖诱导人结肠癌细胞SW1116凋亡时，其形态学的变化. 方法： 选用不同浓度的2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖与人结肠癌细胞SW1116共同孵育不同时间后，采用倒置相差显微镜，荧光显微镜、透射电子显微镜观察人结肠癌细胞SW1116的形态结构变化. 结果： 经2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖的不同浓度作用24~96 h后，观察发现：人结肠癌细胞SW1116出现体积缩小，荧光染色增强，胞核或胞质中可见致密浓染的颗粒状黄绿色荧光染色. 细胞染色质固缩，积聚在核膜边缘呈新月状，内质网疏松并与胞膜融合形成空泡，并呈一定的浓度、时间依赖性. 结论： 2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖在体外具有诱导人结肠癌细胞SW1116凋亡的作用.
【关键词】 2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖；细胞凋亡；结肠肿瘤；SW1116细胞
　　【Abstract】 AIM: To investigate the morphological changes of apoptosis in human colon cancer cell line SW1116 induced by 2［(3carboxy1oxoprogy1) amino］2deoxyDglucose. METHODS: Inverted phase contrast microscopy， fluorescence microscopy， transmission electron microscopy were used to observe the morphological changes of apoptosis in human colon cancer cell line SW1116 induced by different concentrations of 2［(3carboxy1oxoprogy1) amino］2deoxyDglucose at different times (2496 h). RESULTS: The morphological changes of apoptotic cells were exhibited， including shrinkage of cell， condensation of chromatin， breakage of nuclear and formation of apoptotic bodies， and the number of apoptotic cells ascended with the increasing concentration of 2［(3carboxy1oxoprogy1) amino］2deoxyDglucose and with the time going by. CONCLUSION: 2［(3carboxy1oxoprogy1) amino］2deoxyDglucose can induce the apoptosis of human colon cancer cell line SW1116.
　　【Keywords】 2［(3carboxy1oxoprogy1) amino］2deoxyDglucose; apoptosis; colonic neoplasms SW1116 cells
　　0　引言
　　甲壳素是1811年法国学者Braconno发现，1823年由Odier从甲壳类动物外壳中提取，并命名为CHTTIN. 化学名称：聚N乙酰葡萄糖胺，D氨基葡萄糖是甲壳素（chitosan）脱除乙酰基后降解而形成的单糖，甲壳素因为含有羟基，可通过酰化、羧基化、氰化等反应形成不同结构和不同性能的衍生物．常见的有磺化甲壳素、N羟乙壳聚糖、O羧甲基壳聚糖等. 本实验我们利用D氨基葡萄糖的最新衍生物2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖［1］对人结肠癌细胞SW1116的凋亡形态学进行了研究，以探讨该D氨基葡萄糖的衍生物诱导人结肠癌细胞SW1116凋亡的作用，以期为结肠癌的治疗提供新的理论途经.
　　1　材料和方法
　　1.1　材料
　　人结肠癌SW1116细胞购自中科院上海生化细胞所. 2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖由中科院兰州化学物理研究所提供. 四甲基唑氮蓝（MTT）、RPMI1640为Sigma公司产品，倒置相差显微镜、荧光显微镜为Olympus产品，透射电镜为JEM100CX型产品. 2.5 g/L胰蛋白酶、0.1 g/L丫啶橙、100 mL/L小牛血清为上海生物工程有限公司产品.
　　1.2　方法
　　1.2.1　细胞培养将传代的人结肠癌SW1116细胞置于37℃含50 mL/L CO2 温箱内，在含100 mL/L小牛血清、10 g/L双抗的RPMI1640全培养液中培养，48 h换液一次，取对数生长期细胞进行实验.
　　1.2.2　MTT法将贴壁细胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化后计数，调整浓度为5×108/L，接种于96孔板，试验时分成0.02，0.04，0.06 mmol/L 3个不同药物浓度组及空白对照组，每组5个孔，分别于加药后24， 48， 72和96 h测定各孔的A值. 测定前每孔加5 g/L的MTT 10 μL，温育4 h后弃上清，加100 mmol/L DMSO 150 uL/孔，溶解，用酶标仪在490 nm波长下测定，计算细胞生长抑制率（%）=（1-实验组A值/对照组A值）×100%.
　　1.2.2.1　倒置相差显微镜观察将不同浓度的D葡萄糖衍生物作用不同时间的SW1116细胞置于倒置相差显微镜观察其生长状况及形态学变化，同时注意观察其凋亡过程.

　　1.2.2.2　荧光染色细胞片的制备及观察取对数生长期SW1116细胞，制成细胞爬片，经0.04 mol/L 的D葡萄糖衍生物处理72 h后，甲醇冰醋酸固定20 min，加入0.1 g /L丫啶橙10 μL染色30 min，清水冲洗后置于荧光显微镜下观察.
　　1.2.3　透射电镜观察细胞片的制备及观察取对数生长期细胞贴壁生长至培养瓶1/2，弃旧培养液，加入0.04 mol/L的D葡萄糖衍生物作用72 h后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，置离心管中，24 170 g离心20 min后弃上清，收集细胞及空白对照组细胞，PBS洗涤两次，离心后弃上清，先加入30 mL/L戊二醛固定，后锇酸固定50 min，脱水、包埋、聚合、超薄切片，透射电镜下观察凋亡细胞超微结构形态特征.
　　2　结果
　　2.1　倒置相差显微镜观察对照组SW1116细胞贴壁生长良好，细胞轮廓清晰，形态规整，呈梭形或条索状，生长旺盛，几乎无脱落；试验组SW1116细胞生长受到抑制，表现为细胞贴壁能力减弱，由贴壁生长而逐渐脱落，悬浮于培养液中，细胞体积缩小，变圆；出现核固缩，核颜色加深，且有时间和剂量的依赖性，药物剂量越大，一定时间范围内作用时间越长，其生长受抑制就越明显（图1A，B）.

　　2.2　荧光显微镜观察对照组SW1116细胞呈黄色或黄绿色，胞核饱满，胞质表现为橘黄色荧光. 试验组细胞则出现细胞体积明显缩小，荧光染色增强，胞核或胞质中可见致密浓染的块状或颗粒状黄绿色荧光染色，有的可呈现新月形（图1C，D）.
　　2.3　透射电镜观察透射电镜下见对照组SW1116细胞的细胞膜完整，细胞核和细胞器等微结构清晰. 试验组细胞胞质出现明显浓缩，其内微绒毛减少，基质逐渐消失，内质网结构疏松并与细胞膜融合，出现空泡；胞核内的染色质固缩并凝集成块，聚集在核膜周边，出现环状或新月状（图2）
　　3　讨论
　　甲壳素不仅参与人体肝肾解毒，发挥抗炎、刺激蛋白多糖的合成，强化免疫和调节生理机能外，且可抑制肿瘤细胞的增长，其部分衍生物对肿瘤细胞具有更强的诱导分化作用［2］. Wu等［3］利用该衍生物通过体外实验已证实，该衍生物能够明显抑制人肝癌细胞株（HepG2）的生长，同时能诱导其发生凋亡，并且呈一定的浓度、时间相关性.
　　本研究用不同浓度的2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖处理体外培养的SW1116细胞，MTT法研究显示该衍生物对体外培养的人结肠癌SW1116细胞有明显增殖抑制作用，并随着时间和浓度的增加其抑制作用也随着增加，并且在一定的时间范围内有时间、浓度相关性，其中以0.04 mol/L的浓度作用72 h后的抑制作用最明显，出现的凋亡细胞最多；形态学研究时应用倒置相差显微镜、荧光显微镜和透射电镜可观察到凋亡细胞的形态学特征改变：细胞固缩，染色质凝集，细胞核碎裂，呈新月状或颗粒状以及凋亡小体形成；以上研究表明了2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖能诱导人结肠癌细胞SW1116发生凋亡.
　　最新研究表明细胞凋亡是一个多基因调控的复杂过程，主要由诱导基因、抑制基因和双向控制基因相互作用的结果［4］. 因此要诱导人结肠癌细胞的凋亡就离不开促细胞凋亡基因如Caspase3和抑制细胞凋亡基因如bcl2，bclx等之间的相互影响和相互作用，已有不少研究表明［5］以上基因均参与了结肠癌细胞的促凋亡及抑制凋亡的过程，而本研究只是从形态学的角度证实了2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖具有诱导人结肠癌SW1116细胞凋亡的作用，但其具体作用的相关机制、促凋亡基因和抑制凋亡基因如何发挥作用仍需进一步研究和探讨.
【

参考文献

】
　　［1］乔岩，王爱勤，王哲，等. 2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖的合成［J］. 化学试剂， 2004，26(2):107-108.

　　［2］王哲，乔岩，黄高升，等. 氨基葡萄糖及其衍生物诱导白血病细胞K562向巨噬细胞样分化［J］.中国药理学通报，2003，19(3):290-293.

　　［3］Wu J， Kou W， Gao MT ，et al. Effects of {2［(3carboxy1oxoprogy1) amino］2deoxyDGlucose} on human hepatocellular carcinoma cell line. ［J］ Acta Pharmacol Sin， 2005，26(5):635-640.

　　［4］Castaneda F， Kinne RK. Apoptosis induced in HepG2 cells by short exposure to millimolar concentrtion of ethanol involves the Fas receptor pathway ［J］. J Cancer Res Clin Oncol， 2001， 127(7): 418-424.

　　［5］Shinoura N， Muramatsu Y， Yoshida Y， et al. Adenovirusmediated transfer of caspase3 with Fas ligand induces drastic apoptosis in U373MG glioma cells ［J］.Exp Cell Res， 2000， 256(2):423-433.