【摘要】 目的 观察局灶性脑缺血后侧脑室脑室下区N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体亚单位NR2B的表达变化。方法 44只雄性SD大鼠，随机分为正常组、假手术组和脑缺血再灌注组，线栓法制作大脑中动脉栓塞（MCAO）90 min再灌注模型，术后分3、7、14、21、28天5个时间点取脑，连续石蜡切片，免疫组化反应、图像分析系统行NR2B阳性细胞灰度值测量。结果 脑缺血后，缺血侧NR2B的表达在再灌注后3天开始增加，7天达到高峰（P&<0.05），28天降至正常水平（P&>0.05）；缺血对侧的变化趋势同缺血侧，但表达变化的幅度明显减小。结论 局灶性脑缺血后，SVZ区NR2B表达增加，可能参与该区的神经发生。
【关键词】 N-甲基-D-天冬氨酸受体；局灶性脑缺血；脑室下区
Abstract:Objective To investigate the expression of NMDA receptor subunit NR2B in the subventricular zone（SVZ）after focal cerebral ischemia.Methods 44 male SD rats were randomly assigned to 3 groups: normal group， sham-operation group and ischemia/reperfusion group. Transient brain ischemia (90 min) and reperfusion was created by practicing middle cerebral artery occlusion (MCAO). Brain sections cut by paraffin method were processed to test the immunohistochemical reaction of NR2B by SP method and to evaluate the results with LEICA QWin image analysis system.Results Significant increase of NR2B positive cells was found in the SVZ on ipsilateral side on 3 d; the expression of NR2B immunoreactive cells reached a peak on 7 d， and then started to decline. The expression of NR2B on the contralateral side changed in a manner similar to that on the ischemia side， but less in amplitude.Conclusion The present results demonstrate that the sharply increased expression of NR2B in the SVZ might be one of the events involved in the neurogenesis there.
Key words: N-methyl-D-aspartate receptor; focal cerebral ischemia; subventricular zone
N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体是哺乳动物中枢神经系统内谷氨酸受体之一，参与中枢神经系统许多重要的生理和病理过程［1-2］。NMDA受体现已发现并克隆的亚单位有NR1、NR2、NR3、NR4［3］。NR1为功能性亚单位；NR2伴随NR1存在于特定区域，增强NR1对兴奋性氨基酸的反应，可分为NR2A、NR2B、NR2C、NR2D，其中NR2B亚单位最值得关注。NR2B不仅存在于神经元的突触上和突触外，在兴奋性突触传递［4］和神经元兴奋性毒性等方面起重要作用［5］；而且还存在于神经干细胞（NSCs）上［6］，影响中枢神经发生［7］。脑室下区是中枢神经系统重要的神经发生区，以往研究显示，离体培养的脑室下区神经前体细胞可对谷氨酸和NMDA的刺激作出反应［8］，但是在体SVZ区NMDA受体的表达影响因素鲜见报道。因此，本实验应用免疫组织化学方法初步观察了脑缺血对该区NR2B表达的影响，旨在探讨脑缺血与NR2B及脑室下区神经发生之间的关系，为研究该区NMDA受体与神经发生的关系提供一定的理论依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠，体重250～280 g，由徐州医学院实验动物中心提供。将动物随机分为正常对照组（n=4）、假手术组和缺血/再灌注组，后2组动物进一步分为再灌注后3、7、14、21、28天5个时间点，每个时间点每组取4只动物。
1.2 大鼠大脑中动脉（MCA）缺血/再灌注模型制备 采用大鼠大脑MCA阻塞再灌注模型 （MCAO-R），参照Nagasawa法［9］，选用4-0的单股尼龙缝线栓塞右侧MCA。手术组线栓深度距颈总动脉分叉处 (19.5±0.5) mm，栓塞90 min 后回抽出线栓约10 mm，即可恢复MCA血供。手术过程中常规检测肛温，使肛温保持在(37.0±0.5)℃。大鼠术后4 h观察其行为学变化，按Longa评分标准［10］将动物的行为变化分为5级：0级——行为无明显变化；1级——左前肢屈曲，左后肢伸展；2级——有左侧追尾现象；3 级——行走困难，摇摆不定；4级——意识不清。将 1、2、3级动物定为模型成功大鼠，剔除0、4级大鼠。假手术组大鼠尼龙线插入深度为10 mm左右，余同手术组。而正常组大鼠不作任何手术处理。
1.3 NR2B免疫组化反应（SP法） 各组大鼠在相应时间点常规心内灌注，取脑，选取自前囟前1.2 mm至前囟后0.3 mm含侧脑室的组织块，石蜡包埋，切片，片厚6 μm，每间隔3张取1张贴片，进行免疫组化检测。常规脱蜡、复水；微波抗原修复：高火2 min，低火15 min，自然冷却至室温（注：用EDTA抗原修复液在抗原修复盒中进行）； 3％ h3O2 ，25 min，室温； 10％正常兔血清，37℃，1 h（不洗）；滴加山羊抗大鼠NR2B抗体（1∶100，Santa Cruz公司），4℃ 72 h（抗体稀释液为含0.3％Triton X-100的0.01 mol/L PBS液）；复温，37℃ 1 h；滴加生物素化兔抗山羊IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司），37℃ 1 h；滴加辣根过氧化物酶复合物，37℃ 30 min；DAB显色。以上各步骤前后均用0.01 mol/L的PBS(pH 7.2～7.4) 冲洗3次，每次5 min。常规脱水、透明和封片，光镜观察。任取1张切片用正常兔血清代替一抗作阴性对照。
1.4 图像分析 用德国产LEICA QWin图像处理与分析系统进行图像分析。取每个时间点缺血/再灌注组和假手术组(2组必须是同一批反应的) 鼠脑各4只的NR2B免疫反应切片，从每套切片中各选择典型对应的3张切片检测脑室下区NR2B免疫反应的灰度值。测量时，不同鼠脑不同套切片间测量区域和位置相同，每张脑片各测3～4个视野，每个视野测量的像素量(即被测量面积) 保持一致。以上测量值与相应阴性对照切片测量值相减后的平均值为脑室下区NR2B的最终灰度值。
1.5 统计学处理 结果采用SPSS 13.0统计软件分析，数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，多个实验组与一个对照组比较采用最小显著差法（LSD），实验组之间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
正常对照组大鼠脑室下区NR2B阳性细胞胞体圆形或不规则形，胞膜着色，胞核及胞质均不着色，分布于侧脑室的外侧壁，尤以外侧角处集中(图1、2)，左侧和右侧阳性细胞灰度值分别为7.87±1.25和7.36±1.85。脑缺血后NR2B阳性细胞表达增多（表1）。脑缺血后3天，缺血侧的阳性细胞分布区域明显增大，阳性细胞灰度值为相应假手术组的133.1%；缺血后7天，其灰度值达到最大，为相应假手术组的173.7%(图3、4)，同时分布范围较正常组也明显扩大，并沿胼胝体腹侧向外延伸；脑缺血后14天，灰度值开始下降，降至相应假手术组的153.8%；缺血后28天，灰度值降至正常水平（图5、6）。缺血对侧变化趋势同缺血侧，但幅度较小，仅在缺血后7天高于正常水平。其余时间点与正常对照组比较差异无统计学意义（P&>0.05）。 表1 局灶性脑缺血/再灌注不同时间点SVZ区NR2B阳性细胞灰度值比较 与相应假手术组比较：*P&<0.05，**P&<0.01
3 讨 论
前脑脑室下区与海马齿状回（DG）是成年哺乳动物中枢神经发生的主要集中区，在脑结构功能可塑性和脑损伤修复中具有重要意义［11］。脑缺血后，脑室下区神经前体细胞的数量明显增多［12］，这种增多与许多因素有关，其中谷氨酸的作用越来越引起人们的重视。Arvidsson等［13］研究认为大鼠前脑缺血2 h再灌注可以促进脑室下区神经前体细胞增殖，腹腔注射NMDA受体拮抗剂MK-801可以明显阻断局灶性脑缺血引起的细胞增殖；而王细林等［14］则认为腹腔注射MK-801促进该区的神经发生。虽然以上结果存在争议，但都提示NMDA可影响脑缺血后脑室下区的神经发生，可能是该区神经发生调节因素之一。脑缺血是否可以影响脑室下区NMDA受体的表达变化至今未见报道。NR2B为NMDA受体重要的调节亚单位，因此，本实验观察了脑缺血对NR2B表达的影响，旨在探讨NR2B的表达变化及其与脑室下区神经发生的关系。
脑缺血对神经元上NR2B表达的影响已有大量报道［15］。研究显示，脑缺血后NR2B表达增加，12 h达到高峰，3～7天降至正常水平，变化短暂而迅速。脑缺血对脑室下区神经发生影响的研究表明，脑缺血后7天增殖的前体细胞达到高峰，并持续2～3周［16］。本研究结果显示，脑缺血后脑室下区NR2B表达增加。再灌注后3天，大鼠缺血侧NR2B的表达开始增加，7天达到高峰，28天降至正常水平。这种变化不同于脑缺血后神经元上NR2B的改变。这可能是由于脑缺血后谷氨酸的大量堆积。有研究显示，向体外培养的脑室下区神经前体细胞的培养基中添加1 mmol/L的谷氨酸并没有引起前体细胞的死亡［8］，由此我们可以推测大量堆积的谷氨酸刺激NMDA受体过度激活，而NMDA受体活性的改变必然与其亚单位的构成或功能改变有关。也可能由于脑缺血后谷氨酸过量释放，导致NMDA受体过度激活，细胞内Ca2+浓度升高，降低了Id2（bHLH基因中的一种，抑制干细胞向神经元分化）的表达，促进细胞发生［7］，神经前体细胞表达NMDA受体［7，17］，从而引起NR2B表达增加。
本研究从形态学的角度观察了局灶性脑缺血后脑室下区NR2B的表达变化，结果表明脑缺血可以促进NR2B的表达增加，并且这种变化趋势同脑室下区神经发生时间上存在一定的相似性，提示NR2B可能参与该区的神经发生，为进一步研究NMDA受体与神经发生的关系奠定了一定的基础。当然，关于造成脑室下区NR2B改变的原因以及这种改变与该区其他谷氨酸受体之间的关系等，仍需要我们进一步的研究来予以解答。
【
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