关于吡咯烷二硫氨基甲酸酯对大鼠胃缺血/再灌注损伤的影响

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　　　　　　 作者：张咏梅 胡霞 周晓燕 张建福 石玥 马小波 乔伟丽

【摘要】 目的 研究核因子κB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸酯(PDTC)对大鼠胃缺血/再灌注(gastric ischemia/reperfusion， GI/R)损伤的影响。方法 采用夹闭大鼠腹腔动脉30 min，去除动脉夹再灌注1 h的GI/R损伤模型，于静脉注射PDTC后，肉眼计数胃黏膜损伤指数，并运用免疫组化及TdT介导dUTP缺口末端标记(TUNEL)实验技术，观察PDTC对大鼠GI/R后胃黏膜细胞坏死、增殖和凋亡的影响。结果 夹闭大鼠腹腔动脉30 min再灌注1 h后可造成胃黏膜明显损伤，静脉注射PDTC 200 mg/kg可明显减轻GI/R损伤，并使胃黏膜细胞增殖增加、凋亡减少。结论 静脉注射PDTC对GI/R损伤具有保护作用，这种保护作用是通过促进胃黏膜细胞增殖、抑制胃黏膜细胞凋亡而实现的。
【关键词】 胃缺血/再灌注；吡咯烷二硫氨基甲酸酯；增殖；凋亡
　　Abstract:Objective To study the effect of injection of pyrrolidine dithiocarbamate ammonium (PDTC， a nuclear factor κB inhibitor) on gastric ischemia/reperfusion (GI/R) injury.Methods GI/R injury was induced in rats by clamping the celiac artery for 30 min and then reperfusing for 1 h. After the injection of PDTC (200 mg/kg， i.v.)， the gastric mucosal injury index was counted grossly; the effects of PDTC on gastric mucosal cellular proliferation and apoptosis were observed by immunohistochemical and TdT-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL) methods in rats.Results The gastric mucosa was obviously injured after GI/R. PDTC significantly attenuated the GI/R injury， increased the cellular proliferation and decreased the cellular apoptosis in gastric mucosa.Conclusion PDTC can significantly protect against GI/R injury by promoting cellular proliferation and inhibiting cellular apoptosis in gastric mucosa.
　　Key words: gastric ischemia/reperfusion (GI/R); PDTC; proliferation; apoptosis
　　胃缺血/再灌注（gastric ischemia/reperfusion， GI/R）损伤的发生与多种因素有关，如胃黏膜内氧自由基生成过多、内皮素水平升高、胃微循环障碍、白细胞浸润、一氧化氮释放、胃酸分泌增多、前列腺素合成减少等［1-2］。我们前期的研究也表明GI/R后胃黏膜丙二醛(MDA)含量、胃液酸度和胃蛋白酶活性增加，胃黏膜超氧化物歧化酶(SOD)活性明显低于正常对照组［3］，核因子κB(NF-κB)活化及核转位，说明氧自由基及NF-κB均参与GI/R的损伤过程［4-5］。
　　吡咯烷二硫氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate， PDTC)是一种低分子巯基化合物，已广泛应用于临床和基础研究。PDTC有多种生物学活性，如作为重金属的鳌合剂和酶的抑制剂。PDTC还具有抗氧化的作用，从而可对抗氧自由基对组织的损伤。此外，PDTC也是NF-κB信号通路的抑制剂，可抑制NF-κB的活化及核转位［6-7］。由于氧自由基和NF-κB的活化均参与GI/R损伤过程，因此我们推测静脉给予PDTC后可能对GI/R损伤具有保护作用。
　　因此，本研究通过建立GI/R模型，应用免疫组化等方法，探讨了静脉给予PDTC后对GI/R损伤的影响及可能的作用机制。
　　1 材料和方法
　　1.1 试剂 PDTC购自美国Sigma公司， PCNA(anti-proliferating cell nuclear antigen antibody)小鼠单克隆抗体、 PowerVisionTM二步法免疫组化检测系统、DAB显色试剂盒、枸橼酸盐缓冲盐溶液、多聚赖氨酸溶液购自北京中杉生物技术有限公司；TdT介导dUTP缺口末端标记 (TUNEL)试剂盒购自Chemicon公司；其他试剂均为市售化学纯。
　　1.2 实验动物及分组 成年健康Sprague-Dawley (SD)大鼠(220～240 g)，雄性，由徐州医学院实验动物中心(使用许可号: SYXK［su］2002-0038)提供。实验前禁食24 h、自由饮水。将SD大鼠随机分为3组，每组6只：假手术对照组（sham组）、GI/R组、PDTC+GI/R组。PDTC用生理盐水溶解，采用200 mg/kg剂量，于GI/R前20 min经股静脉给药。
　　1.3 GI/R动物模型的制备 按Wada等［8］方法进行。实验大鼠水合氯醛麻醉后，仔细分离腹腔动脉与周围组织，用小动脉夹夹闭腹腔动脉30 min后去除动脉夹恢复血流再灌注60 min。实验结束后取胃计数胃黏膜损伤指数。
　　1.4 胃黏膜损伤指数测定 参照Guth等［9］方法加以改进。以腺胃区局限于胃上皮的点状糜烂、溃疡、出血灶的长度累积计分：正常为0分；损伤≤1 mm计1分；～2 mm计2分；～3 mm计3分；余类推；损伤宽度超过1 mm时，分数加倍。每组大鼠损伤分数的平均值为损伤指数。测量完损伤指数后将胃组织在10%中性甲醛溶液内固定，石蜡包埋切片后用于免疫组化检查。
　　1.5 免疫组织化学染色法观察胃黏膜细胞增殖 PCNA染色步骤按照北京中杉生物技术有限公司提供的PowerVisionTM二步法免疫组化检测系统进行。DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。光镜下观察到胞核内有棕色颗粒者，即为阳性细胞。用Image-Pro Plus 图像分析系统对阳性细胞数进行半定量分析。以高倍视野下阳性细胞数占整个视野细胞总数的百分比作为分析指标。对照实验以PBS缓冲液代替一抗。每例3张间断切片，每张切片随机选取10个视野，取平均值。
　　1.6 胃黏膜细胞凋亡的形态学检测 采用ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection试剂盒，按说明书操作进行TUNEL染色。试剂盒简单操作步骤如下：胃组织石蜡切片常规脱蜡、梯度乙醇水化，3% h3O2室温作用10 min，蛋白酶K 20 mg/L消化20 min，TdT酶和核苷酸混合物中37℃孵育1 h中止反应，anti-digoxigenin结合物室温孵育30 min，DAB溶液显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察到胞核内有棕色颗粒者，即为阳性细胞，分析方法同上。
　　1.7 统计学处理 数据以x±s表示，多组间比较采用完全随机设计方差分析法（ANOVA）。
　　2 结 果
　　2.1 PDTC对胃缺血/再灌注1 h后胃黏膜损伤的影响 GI/R 1 h可引起胃黏膜明显损伤，其胃黏膜损伤指数为132.5±47.6，静脉注射PDTC 200 mg/kg后，可显著减轻GI/R 1 h后的胃黏膜损伤，胃黏膜损伤指数为54.1±24.7(P&<0.01，与GI/R组比较)。
　　2.2 PDTC对胃缺血/再灌注1 h后胃黏膜增殖的影响 胃黏膜PCNA阳性细胞（即增殖细胞）表达在黏膜层中上1/3交界处附近，假手术组（只开腹，不夹闭动脉）即正常胃黏膜此处有一定量的增殖细胞，增殖阳性细胞百分比为(46.1±12.6)%。GI/R 1 h后增殖阳性细胞百分比为 (17.0±2.4) %，增殖细胞较假手术组明显减少(P&<0.01，与sham组比较)，是假手术组的41.4%，静脉注射PDTC(200 mg/kg)可明显增加GI/R 1 h后PCNA蛋白的表达水平，增殖阳性细胞百分比为(38.6±8.3)%，较GI/R组明显增加(P&<0.01，与GI/R组比较)，是GI/R组的2.3倍(图1)。
　　图1 免疫组化染色观察PDTC对胃缺血/再灌注后胃黏膜PCNA表达的影响(标尺：50 μm)2.3 PDTC对胃缺血/再灌注1 h后胃黏膜细胞凋亡的影响 胃黏膜凋亡阳性细胞表达在黏膜全层。假手术组即正常胃黏膜有一定量的凋亡阳性细胞，且以胃黏膜中上1/3交界处附近较多，凋亡阳性细胞百分比为(28.5±6.7)%。GI/R 1 h后凋亡阳性细胞明显增加且分布范围较广，见于胃黏膜全层，凋亡阳性细胞百分比为(48.3±3.6)%，较假手术组明显增多(P&<0.01，与sham组比较)，是假手术组的1.7倍，静脉注射PDTC (200 mg/kg)可明显减少GI/R 1 h后凋亡阳性细胞的表达水平(P&<0.01，与GI/R组比较)，其百分比为(8.7±2.8)%，是GI/R组的18% (图2)。
　　图2 TUNEL染色观察PDTC对胃缺血/再灌注后胃黏膜凋亡细胞表达的影响(标尺：50 μm)
　　3 讨 论
　　目前认为PDTC作为NF-κB信号通路的抑制剂及抗氧化剂，对多种器官的缺血/再灌注损伤具有保护作用，如PDTC可抑制小肠缺血/再灌注后多形核白细胞的浸润，降低MDA含量，从而减轻小肠缺血/再灌注损伤，说明PDTC对肠缺血/再灌注损伤的保护作用与其抗炎和抗氧化作用有关［6］。PDTC还可明显减轻心肌、脑、肺、肝脏、骨骼肌和肾脏等器官的缺血/再灌注损伤，其作用机制与抑制NF-κB的活化和核转位、抑制氧自由基的生成有密切的关系［10-13］。El Eter等［14］亦发现PDTC通过抑制NF-κB的活性，减少TNF-α等细胞因子的表达来减轻胃缺血/再灌注损伤。但目前尚未见到PDTC对GI/R后胃黏膜细胞凋亡和增殖影响的报道。因此，本研究采用了免疫组化（检测PCNA）、TUNEL等方法，观察整体情况下PDTC对胃黏膜细胞凋亡和增殖的影响。

结果发现，正常胃黏膜存在一定数量的凋亡细胞和增殖细胞。增殖细胞主要表达在胃黏膜上中1/3处附近，即胃腺颈区，组织学上认为，此部位是胃黏膜的“生发层”，分布在这个部位的细胞主要是一些未分化的细胞，它们最终分化成为壁细胞、主细胞和黏膜上皮细胞，并逐渐移行至胃黏膜的下层或上层。可见，胃黏膜是代谢旺盛的组织，黏膜细胞的增殖和凋亡是维持正常胃黏膜完整性，参与组织损伤后修复的两个必不可少的过程［15］。GI/R损伤后增殖细胞表达明显减少，而凋亡细胞表达则明显增多，且分布范围增加，在整个胃腺区均存在。表明在GI/R发生的过程中，胃黏膜细胞凋亡和增殖之间的失衡，是胃缺血/再灌注损伤发生的重要原因。静脉注射PDTC后，不仅能明显减轻GI/R后黏膜的损伤、糜烂坏死，同时增加胃黏膜PCNA阳性细胞（增殖阳性细胞）的表达，减少凋亡阳性细胞的表达。所以PDTC对GI/R损伤的保护作用，表现为促进黏膜细胞的增殖和抑制其凋亡。
　　综上所述，我们可以得出以下结论：PDTC对GI/R损伤具有显著的保护作用，这种保护作用在胃黏膜局部是通过其促增殖、抑凋亡实现的，从而为临床治疗胃黏膜损伤提供了理论依据。

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