衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)的克隆、表达及纯化

　　　　 作者：王飞　 朱庆三 苗旭漫 胡宁宁 李霄 金宁一

【摘要】 目的 构建含衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)的原核表达载体，经转化E.coli以表达CPAF融合蛋白，研究其生物学功能。方法 从病料中克隆得到CPAF的原始基因，将PCR产物经纯化连接到pMD18T，将重组质粒pMDCPAF经NdeI和BamHI双酶切，与用相同酶消化的原核表达载体pET42b(+)连接，建立pET42b(+)CPAF表达载体，阳性克隆经鉴定后，转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达，经亲和纯化、离子交换纯化、分子筛纯化融合蛋白，进行SDSPAGE分析，Western印迹检测。结果 经酶切鉴定和测序分析证实原核表达质粒构建正确。SDSPAGE和Western印迹结果显示在70 kD处呈现单一蛋白条带，pET42b(+)CPAF重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达了CPAF天然蛋白，目的蛋白占全菌体蛋白的20%左右，采用镍柱的亲和纯化后，可达70%左右。结论 经DNA测序、SDSPAGE、Western印迹检测表明成功构建了能够稳定表达可溶性CPAF的菌株，并获得纯化CPAF的方法，为今后CPAF的研究及应用奠定了基础。

【关键词】 衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF);表达;纯化;生物学功能

衣原体泌尿生殖道感染是艾滋病病毒(HIV)感染的重要危险因素，也是人乳头状瘤病毒(HPV)致宫颈癌的协同因子。衣原体具有广泛的宿主，尽管不同种属衣原体的宿主不尽相同，然而他们却拥有极其相似的基因组序列和高度保守的细胞内生活周期。衣原体要确保完成其胞内繁殖，就必须保证受浸染细胞不被机体免疫细胞识别，从而逃逸宿主的免疫防御。衣原体拥有多种策略来逃逸宿主的免疫防御，衣原体蛋白酶样活性因子(chlamydial protease activity factor，CPAF)就是重要的一种因子，其作用的机制是通过降解形成肌球蛋白重链(MHC)所必须的转录因子，例如：调节因子X5(RFX5)和上游刺激因子1(USF1)，来达到抑制MHC合成的作用〔1〕。人类受到衣原体感染时，CPAF特异性抗体效价明显高于外膜蛋白(MOMP)和热休克蛋白60(HSP60)，这说明CPAF具有良好的免疫原性。同时，人体内针对CPAF的抗体具有良好的中和效应，并能够有效保护机体免受感染，具有抑制衣原体感染的效果〔2〕。种种迹象表明CPAF极有可能成为潜在的衣原体免疫原，运用到将来的疫苗开发中。本研究选择对CPAF进行全序列基因克隆，并在不同的载体系统中表达CPAF，获得可溶性蛋白，同时摸索出能够大量制备高纯度蛋白的纯化方法，为下一步应用奠定良好的基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌株与载体 表达载体pET42b(+)载体及工程菌BL21(DE3)由本研究室保存;pMD18T vector购自大连宝生物公司。

　　1.1.2 病料 沙眼衣原体分离于病人组织。

　　1.1.3 主要试剂 工具酶均购自大连宝生物公司，常用试剂及质粒提取试剂盒购自Sigma公司;PCR纯化及凝胶回收试剂盒购自Qiagen公司;胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxiod公司。其他生化试剂均为国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 模板的制备 按照细菌基因组提取方法改进提取，在第5步之后将上清加入Sigma试剂盒中的柱子，其后步骤按照Sigma质粒提取试剂盒说明书操作。

　　1.2.2 PCR引物设计 应用Primer5.0设计引物，由大连宝生物公司合成。CPAF上游引物5′GCCCGGCATATGCTCCTGTACAAGGAG3′(引入NdeI位点)，下游引物5′CTTGGGATCCAAAACTACCATCTT3′(引入BamHI位点)。

　　1.2.3 目的基因扩增 按如下程序进行PCR循环：95℃预变性5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，共循环30次，最后72℃延伸10 min。PCR产物的纯化按照Qiagen公司PCR纯化试剂盒说明书进行。

　　1.2.4 基因克隆 将PCR产物经纯化连接到pMD18T后转化工程菌JM109。用PCR、双酶切筛选阳性克隆，阳性重组子命名为pMDCPAF，送公司测序。

　　1.2.5 构建表达载体 将pMDCPAF用NdeI和BamHI两种酶同时消化，得到目的基因CPAF。目的基因纯化按照Qiagen凝胶回收纯化试剂盒说明书进行。将CPAF与用相同酶消化的原核表达载体pET42b(+)连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)后涂布含有卡那霉素(50 mg/L)的固体培养基，经PCR、酶切进行阳性克隆筛选，将阳性重组子命名为pET42b(+)CPAF。

　　1.2.6 诱导表达 挑取阳性单克隆，接种于2 ml LB/Kanr液体培养基中，37℃摇床，250 r/min过夜培养。次日以1∶100比例接种至200 ml LB/Kanr液体培养基中，37℃ 250 r/min培养至OD600=0.6～1。加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1 mmol/L，37℃诱导5 h后，4 000 r/min离心10 min收集菌体，用40 ml TE缓冲液将沉淀重悬，超声波破碎裂解菌体，离心后收集上清，用于检测可溶性表达。

　　1.2.7 SDSPAGE凝胶电泳检测 常规制备13%分离胶和4.5%浓缩胶电泳，考马斯亮蓝染色后用凝胶扫描影像系统拍照，并用系统软件分析蛋白含量同时确定目的蛋白分子量。

　　1.2.8 CPAF的亲和纯化 将破碎上清液用0.45 μm滤膜过滤后加至经0.02 mol/L Tris缓冲液(pH8.0)平衡好的Ni2+柱，用含有0.015 mol/L咪唑的0.02 mol/L Tris缓冲液(pH8.0)洗去未结合的杂蛋白，然后用含有0.25 mol/L咪唑的0.02 mol/L Tris缓冲液(pH8.0)将CPAF蛋白解离下来。

　　1.2.9 CPAF的离子交换纯化 采用蛋白液相层析纯化(AKTA)系统进行纯化，阴离子纯化柱采用Source Q，溶液A为不含NaCl的0.02 mol/L Tris缓冲液(pH8.0)，溶液B含1 mol/L NaCl的0.02 mol/L Tris缓冲液(pH8.0)。程序如下，将上述经亲和纯化解离的样品用A液稀释5倍后，直接上用A液平衡好的QFF柱，上完样品之后用1个柱体积的A液预洗涤，之后按照程序将A、B液混合，逐渐提高B液的含量进行梯度洗涤，用自动收集器收集样品，每管收集0.5 ml。

　　1.2.10 CPAF的分子筛纯化 采用AKTA系统进行纯化，分子筛纯化柱采用Superdex200，溶液C为含0.15 mol/L NaCl的0.02 mol/L Tris缓冲液(pH8.0)。程序如下，将上述经离子纯化的样品经30 kD孔径的超滤膜进行超滤浓缩，将浓缩的样品直接上用C液平衡好的Superdex200柱，样品上完之后用1个柱体积的C液预洗涤之后开始用自动收集器收集样品，每管收集0.5 ml。

　　1.2.11 Western印迹检测 将初步纯化的CPAF蛋白经过SDSPAGE后，转到硝酸纤维素膜，以鼠抗组氨酸标签抗体作为一抗，进行常规Western检测。

　　2 结 果

　　2.1 目的基因PCR结果及阳性重组载体pET42b(+)CPAF的构建与鉴定 将pMDCPAF克隆载体用NdeI和BamHI两种酶同时消化，得到目的基因CPAF。用T4 DNA连接酶将目的基因与用相同酶消化的表达载体pET42b(+)连接(图1)。设计引物时在目的基因的末端不含终止密码子，表达蛋白为带有组氨酸标签的融合蛋白。见图1，图2。

　　图1 pET42b(+)CPAF 的构建示意图图2 CPAF的PCR扩增产物

　　2.2 CPAF融合蛋白表达条件的确定 经过摸索确定的最佳诱导表达条件如下：IPTG终浓度为1 mmol/L，培养菌的温度及诱导温度均为37℃，最佳诱导时间为5 h(5 h时蛋白浓度达最大，延长时间表达量没有明显变化)。取诱导前、全菌体、破碎上清、破碎沉淀进行13%浓度SDSPAGE电泳，考马斯亮蓝染色，诱导后与诱导前相比在13 kD处存在一条明显的特异带，说明pET42b(+)CPAF重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)中得以成功表达，目的蛋白绝大部分存在于破碎上清中，说明该蛋白为可溶性表达，这为以后研究其佐剂功效奠定了良好的基础。经Imagemaster VDS Pharmbta Biotech凝胶扫描影像系统分析，目的蛋白占全菌体蛋白的20%左右。

　　2.3 CPAF的纯化

　　2.3.1 CPAF的亲和纯化 融合CPAF蛋白带有6个组氨酸标签，采用镍柱的亲和纯化后，蛋白的纯度可达70%左右，这时候蛋白在含有高咪唑的环境中很不稳定，需要立即稀释并迅速进行离子交换柱的纯化。

　　2.3.2 CPAF的离子交换纯化 采用AKTA系统进行纯化，阴离子纯化柱采用Source Q，CPAF蛋白在pH8.0的Fris缓冲液条件下能够很好的结合在离子交换树脂上，易于分离纯化，同样也易于解离下来，见图3。

　　图3 CPAF经Source Q阴离子交换柱纯化图

　　2.3.3 CPAF的分子筛纯化 采用AKTA系统进行纯化，分子筛纯化柱采用Superdex200，该步骤的目的主要是进一步纯化CPAF蛋白，同时改变蛋白的环境，使其处在一个低盐的环境中，见图4。

　　2.4 Western检测结果 纯化产物在目的位置出现单一特异性条带，未诱导的表达产物未见特异性条带。见图5。

　　图4 CPAF经Superdex200分子筛纯化图1: pET42b(+)CPAF;2: 单纯重组CPAF;3:未诱导的表达产物

　　图5 重组蛋白表达产物及纯化产物的Western分析

　　3 讨 论

　　近年来，由衣原体引起的性传播疾病(STD)在许多国家已超过了淋病和梅毒。根据WHO估计，每年有9 200万新的泌尿生殖道衣原体感染病例发生，其中美国每年大约有400万新感染者。我国泌尿生殖道沙眼衣原体感染居STD第三位，并且发病率呈逐年升高趋势。衣原体具有无症状感染特性，感染后可能产生不孕、异位妊娠、盆腔炎等严重的后遗症，甚至还可以协同HPV感染和HIV经性传播。

　　衣原体全基因组序列分析发现编码多形态膜蛋白基因家族的存在。已发现鹦鹉热嗜衣原体至少有6个基因编码Pmp90和Pmp98蛋白家族，Cpn有21个基因编码Pmp1～Pmp21，衣原体有9个基因编码PmpAPmpH，其中Ct的PmpD(Cpn的Pmp21)引起过人们的广泛关注〔3〕。衣原体不同型别间的核苷酸差异多发生于4个VD区域，因此检测编码VDs的外膜蛋白omp l碱基序列和数目即可达到对衣原体分型的目的。根据其主要外膜蛋白抗原表位差异可将衣原体分为19个血清型，其中A、B/Ba、C型引起地方性沙眼，L1、L2 /L2a、L3型引起性病性淋巴肉芽肿，而D～K型则主要感染泌尿生殖道，是引起尿道炎和宫颈炎的重要原因〔4〕。近年来人们又将目光聚集在CPAF上，人体内针对CPAF的抗体具有良好的中和效应，并能够有效保护机体免受感染，具有抑制衣原体感染的效果〔5，6〕。这一点给了人们不少启示，认为CPAF可能成为衣原体潜在的免疫原〔7，8〕。由于衣原体只能在活细胞内生长，通过大规模培养衣原体，并分离、纯化天然的CPAF很困难，为研究CPAF的功能和其生物活性，故采用 DNA重组技术克隆和表达重组CPAF。但是CPAF具有跨膜区域，全长的CPAF表达量非常低而且常常形成不可溶的包涵体。本文根据CPAF的二级结构根据不同区域的疏水性筛选CPAF片段，最终发现从第53个氨基酸开始到596个氨基酸结束，这个片段的表达产物为可溶性的。这样仅仅减少的几个疏水部分就能导致蛋白的可溶，并提高了产物的表达量。该蛋白的纯化具有相当的难度，CPAF在纯化过程中很容易沉淀，全程均需要在4℃下进行，该蛋白对盐离子浓度非常敏感，故在经过阴离子交换柱后，蛋白应尽快过分子筛，主要目的是脱盐，保持其处在一个低盐的环境中，有利于保持其稳定性。

参考文献

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