益脑颗粒对亚急性衰老大鼠慢性脑缺血模型脑组织中HSP70表达的影响

　　　　　　 作者：钟丽红 魏春敏 李鲁杨

【摘要】 目的 观察益脑颗粒对慢性脑缺血大鼠脑组织中HSP70表达的影响，探讨益脑颗粒治疗慢性脑缺血的作用机制。方法 采用Dgal注射诱导亚急性衰老大鼠模型，永久性双侧大鼠颈总动脉结扎术(2VO)制备亚急性衰老大鼠慢性脑缺血模型。给予高、低剂量益脑颗粒灌胃，并以尼莫地平为对照，免疫组化法观察大鼠脑组织中HSP70表达。结果 模型组脑组织中HSP70表达无明显改变(P>0.05)，益脑颗粒高、低剂量组表达升高(P<0.01)，尼莫地平组无明显改变(P>0.05)。结论 益脑颗粒能通过增加缺血脑组织中HSP70的表达，改善慢性脑缺血。

【关键词】 补肾活血方;慢性脑缺血;衰老大鼠;HSP70

　　【Abstract】 Objective To observe the effect of Yinao granule on the HSP70 expression in brain of chronic cerebral ischemia model of subacute aging rats. Methods Healthy male Wistar rats were randomly pided into control，model， highdose， lowdose Yinao granule and nimodipine groups. Subacute aging model was induced by Dgal injection and chronic cerebral ischemia model was made by ligation of bilateral arteria carotis. The expression of HSP70 was measured by immuohistochemical method. Results There was no difference on HSP70 expression between model and control group (P>0.05). There were high expressions in high and lowdose Yinao granule groups(P<0.01)and highdose group was superior to lowdose group(P<0.01). There was no obvious change of HSP70 expression in nimodipine group.Conclusions Yinao granule can improve the HSP70 expression in brain of ischemic cerebral tissue， and pretect brain cell by preventing oxidation and inhibiting apoptosis of nerve cells.

　　【Key words】 Yinao granule; Cerebral ischemia; Rats; HSP70

　 持续性脑血流量下降引起多种细胞因子及抗凝因子比例失衡，是血管性痴呆、Alzheimer病和Binswanger病等多种疾病发展过程中的一个共同病理过程，尽快改善和恢复缺血损伤脑组织的血液供应是慢性脑缺血治疗的关键。细胞在受到缺氧、氧化损伤、病毒感染和免疫紊乱等各种应激因素损伤时，为适应周围微环境的改变，会暂时性下调多种细胞自身产物和选择性上调热休克蛋白(HSP)的表达〔1〕。HSP的诱导表达具有保护细胞免受微环境中各种有害因素的损伤，减小组织的梗死面积，减轻脏器损伤，以及降低致死性应激状态下动物死亡率的作用〔2〕。正常脑组织中HSP70含量极少，缺血缺氧时表达增多，沙土鼠脑缺血后，HSP70的表达主要位于海马及大脑皮层〔3〕。益脑颗粒是以中医基础理论为指导，结合现代医学研究成果拟定的，由黄芪、制首乌、银杏叶、大黄、莪术、水蛭、三七粉等多味中药组成，具有健脾益脑、补肾活血之功效。本研究应用衰老大鼠慢性脑缺血模型，观察益脑颗粒对脑组织HSP70表达的影响，阐明本方改善慢性脑缺血的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及分组 6周龄清洁级健康雄性SD大鼠60只，体重(200±20)g，由山东大学实验动物中心提供。随机分成正常组、模型组、益脑颗粒高、低剂量组、尼莫地平组，每组12只。

　　1.2 药品与仪器 黄芪、何首乌、银杏叶、大黄、莪术、水蛭、三七粉等中药饮片购自山东省医药采购供应站;D半乳糖(Dgal)由北京拜尔迪生物公司提供(批号：00637);尼莫地平片由山东新华制药股份有限公司生产(批号：0605173)。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 模型制备 模型组、益脑颗粒高、低剂量组、尼莫地平组大鼠以50 mg/kg颈背部皮下注射0.5% Dgal生理盐水溶液，诱导亚急性衰老模型，正常组用等量生理盐水颈背部皮下注射。4 w后以10%的水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔内注射麻醉，仰卧位固定，颈部去毛，强力碘消毒，颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，并套以“1”号手术线永久性结扎，制备老年慢性脑缺血模型〔3，4〕，并继续皮下注射Dgal。正常组不做处理，继续生理盐水注射。术后给予硫酸庆大霉素4 000 U/100 g肌内注射，预防感染。

　　1.3.2 制备益脑颗粒 黄芪、何首乌、银杏叶、大黄、莪术等粗粉按5∶5∶2∶2∶2比例，分别加入10、8、8倍量水，煎煮提取3次，静置沉淀24 h，上清液浓缩成膏，烘干、粉碎成细粉，加入水蛭粉(水蛭低温烘干粉碎)和三七粉(投药量均为黄芪的1/10)混匀，平铺一薄层，紫外灯照射45 min，加入95%酒精，用12目筛制粒，60℃～80℃干燥，整粒，每克益脑颗粒相当于生药4.2 g。

　　1.3.3 给药 益脑颗粒以蒸馏水稀释成30和15 mg/ml混悬液，高、低剂量组分别按0.6和0.2 g·kg-1·d-1灌胃给药，尼莫地平组以40 mg·kg-1·d-1给予尼莫地平混悬液(2 mg/ml)灌胃，模型组和正常组灌服等量蒸馏水，每天两次给药，4 w后，断头取脑，制作脑组织标本。

　　1.3.4 测定方法 采用免疫组化染色(SP法)。兔抗大鼠的HSP70多克隆抗体 1∶100及SP法试剂盒购自武汉博士德生物公司，按SP法试剂盒说明进行操作。所形成的复合物与DAB 反应后呈棕褐阳性，并经苏木素复染细胞核对比染色。每次染色时均同时以 PBS液替代一抗作阴性对照。

　　1.3.5 图像分析方法 应用Leica QwinV3图像分析软件对切片进行图像分析。所有切片均在同一光强度下，同一放大倍数下进行分析。每例大鼠测量3张切片，每张切片选定 3个不同视野测定平均灰度。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS 10.0软件进行统计分析，各项数据均以x±s表示，各组比较采用多样本均数的方差分析。

　　2 结 果

　　正常组脑组织切片平均灰度为124.910±6.191(n=12)，模型组为131.270±6.286(n=8)，益脑颗粒高剂量组为165.65±11.060(n=11)，益脑颗粒低剂量组为150.10±10.64(n=11)，尼莫地平组为136.543±7.417(n=10)。与正常组比较，模型组脑组织血管内皮中HSP70表达无明显差异(P>0.05);与模型组比较，治疗益脑颗粒高、低剂量组HSP70表达增高(P<0.01)，尼莫地平组表达无明显变化(P>0.05)，且益脑颗粒高剂量组优于低剂量组(P<0.01)，见图1。

　　3 讨 论

　　中医认为“气血互根、脉为血之府”，补气活血与行气活血方药具有促血管生成作用。益脑颗粒以中医基础理论为指导，结合现代医学研究成果及临床经验，以黄芪为君，健脾益气，制首乌为臣，补肾填精而生髓健脑，辅以莪术、三七等活血，可较好地改善脑血流量，改善患者的临床症状。为探讨其可能的作用机制，本研究模型脑组织病理学显示呈缺血性改变，以观察益脑颗粒对该模型脑组织中与神经细胞存亡有关的细胞因子HSP70的影响。HSP70是与脑缺血相关的重要因子。研究表明〔4～6〕，HSP70表达对脑缺血有保护作用，其可能的机制有：减少氧自由基的产生，抗氧化保护脑细胞;清除细胞内异常蛋白的作用，加速脑细胞损伤的修复;减轻损伤刺激或应激反应引起的细胞膜蛋白变性;抑制神经细胞的凋亡。本实验研究结果基本与上述研究一致，但所用大鼠为致衰大鼠，衰老状态下机体对各种应激反应能力减弱。随机体的老化，HSP70的合成及功能均有下降，本研究中脑缺血后HSP70表达未见明显增加，但经高剂量益脑颗粒治疗后，其表达明显增加。

参考文献

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