钨酸锂抑制β淀粉样蛋白分泌及神经元的保护作用研究

　　　　　　作者：侯军代 路露 张晓裕 罗焕敏

【摘要】 目的 研究钨酸锂对人淀粉样前体蛋白及早老素1（M146L）细胞分泌β淀粉样蛋白（Aβ142）的影响及其对体外培养新生小鼠大脑皮层神经元的保护作用。方法 ①体外培养转染AD相关基因、可分泌Aβ142的M146L细胞，在培养液中加入低、中、高剂量（3.1、5、8 mmol/L）钨酸锂或阳性对照药，通过对M146L细胞活性及培养基中Aβ142含量的测定，研究钨酸锂对M146L细胞分泌Aβ142的影响。②体外无血清培养新生小鼠大脑皮层神经元，采用NSE免疫细胞化学染色法进行神经元鉴定；观察神经元突起生长状况，分析研究钨酸锂对大脑皮层神经元的神经保护作用。结果 ①低、中、高剂量钨酸锂对M146L均无细胞毒性；②低、中、高剂量钨酸锂可抑制M146L细胞分泌Aβ142；③原代培养的新生小鼠大脑皮层神经元，经NSE免疫细胞化学染色被染成棕褐色的细胞占绝大多数，表明所培养细胞基本为神经元；④除低浓度（0.008 mmol/L）外，终浓度分别为0.2，0.04 mmol/L的钨酸锂均能明显使突起数目和长度增加，可促进神经元的存活。结论 适量的钨酸锂可抑制M146L细胞分泌Aβ142；对新生小鼠大脑皮层神经元具有神经保护作用。

【关键词】 钨酸锂；阿尔茨海默病；M146L细胞；β淀粉样蛋白；神经保护作用

　　【Abstract】 Objective To explore the effects of lithium tungstate (LT) on the secretion of amyloid betaprotein 142（Aβ142）of M146L and the neuropretection on neurons from cerebral cortex of newborn mouse in vitro. Methods ① M146L cells were culture by low， middle and high dose of LT or positive control drug and the cell activity and the content of Aβ142 were detected. ② The neurons from cerebral cortex of newborn mouse were cultured in B27supplemented neurobasal， a new serumfree medium combination， and identified by NSE staining; MTT assay was carried out to investigate the effect of the LT on development of neurons. Results ①Different concentrations of LT had no influence on the survival of M146L cells；② Different concentrations of LT could inhibit the secretion of Aβ142 by M146L cells；③Most of the neurons were stained to be positive with NSE， which suggested them being neurons; ④The results showed that LT (0.04 mmol/L， or 0.2 mmol/L) could increase the number and the length of neurites as well as the number of survival neurons. Conclusions Adequate LT could inhibit the secretion of Aβ142 by M146L cells and has a neuroprotective effect on the neurons from cerebral cortex of newborn mouse.
　　
　　【Key words】 Lithium tungstate; Alzheimer′s disease; Amyloid betaprotein; M146L cells; Neuroprotective effect

　　β淀粉样蛋白（Aβ142）生成抑制剂是目前阿尔茨海默病（AD）药物研发的重要方向，这类药物大多仍处于实验研究阶段，个别进入临床研究。近年研究表明，氯化锂具有神经保护作用，可拮抗多种因素诱导的神经元凋亡，在一定程度上促进神经元发生〔1〕。Phiel等研究发现氯化锂可通过抑制GSK3α而减少Aβ分泌〔2〕。同时，有研究发现钨酸钠亦是一种GSK3抑制剂〔3〕，并且与氯化锂合用具有协同作用〔4〕。因此，作者设想将氯化锂和钨酸钠经化学方法合成钨酸锂，其作用可能更优。本实验通过钨酸锂与前几种试剂对神经元作用的对比来验证这一假说，并探寻一种更佳的Aβ142生成抑制剂。钨酸锂为本实验室首次合成，也是国内外首次探讨钨酸锂对Aβ表达的影响，具有自主知识产权（专利号：ZL200710027721.1）。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物 昆明种小鼠（广东省实验动物实验中心提供，合格证号：2003A003）

　　1.1.2 试剂 M146L细胞株（美国哈佛大学医学院张冀民博士惠赠），钨酸锂（暨南大学脑科学研究所神经药理研究室提供，批号：061230），氯化锂（天津市科密欧化学试剂公司，批号：00060529），钨酸钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20060419），DMEM细胞培养基（美国Gibco公司，货号：12100046），人类Aβ142 ELISA试剂盒（日本WAKO公司，批号：4008），重组人碱性成纤维细胞生长因子（rhbFGF，R﹠D，批号:AU824031），其他试剂均为国产分析纯。

　　1.1.3 仪器 680型全自动酶标仪（美国Biorad公司），3K18型低温高速离心机（美国Sigma公司），细胞培养板（美国Corning公司）。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 钨酸锂对M146L细胞活性及其分泌Aβ的影响 M146L细胞培养，复苏M146L细胞株，用含15%胎牛血清的DMEM培养液培养。该培养液含G418（200 μg/ml）、嘌罗霉素（puromycin，25 μg/ml）两种抗真核细胞抗生素，进行抗性筛选。37℃、饱和湿度、5%CO2条件下培养，每2 d换液传代培养，取指数生长期的细胞进行实验。(1)细胞活性测定。①取对数生长期的M146L细胞，用培养液调为单细胞悬液，浓度为2.5×105个/ml。96孔圆底细胞培养板每孔加入200 μl以上悬液，培养8 h后，弃液冲洗后，取DMEM培养液195 μl及低、中、高钨酸锂各5 μl，使终浓度分别为3.1、5、8 mmol/L。另设空白对照组、氯化锂组、钨酸钠组、氯化锂+钨酸钠混合组，各加相应药液5 μl，后三组终浓度分别为20、5、（5+5）mmol/L，各剂量组重复8孔。②培养24 h后，吸出培养液，各孔加新鲜DMEM培养液Ⅱ 180 μl及5 mg/ml MTT 20 μl。继续培养4 h后弃上清，加150 μl二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min至晶体完全溶解，置酶标仪上，490 nm波长下测定各孔吸光度（OD值）。(2)Aβ142含量测定(酶联免疫吸附测定法)。标准蛋白配制浓度依次为（单位pmol/ml）：100，50， 25，10，2.5，1，0；①与细胞活性测定①相同；②继续培养24 h后，每孔取100 μl培养液。试剂空白对照组加入缓冲液100 μl，空白样本对照组、加药组和标准品组中各加入100 μl相应试剂；③4℃孵育过夜，缓冲液冲洗彻底弃去，空白样本对照组、加药组和标准品各孔中均加入标记抗体100 μl；4℃孵育1 h，重复冲洗5次，加入染料，室温下避光放置30 min；④每孔加100 μl终止液混匀，液体变黄。用450 nm波长检测。

　　图1 体外培养大脑皮层神经元的鉴定(NSE，×250)（略）

　　1.2.2 钨酸锂的神经保护作用 (1)新生小鼠大脑皮层神经元无血清培养及鉴别:取新生昆明种小鼠（＜24 h）大脑皮层组织，用神经元培养液制成单细胞悬液，接种于预先涂布0.012 5％L多聚赖氨酸的24孔培养板上，每孔接种12～13万个细胞，接种培养4 h开始实验。采用神经元特异性烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染色法进行神经元鉴定，染成棕褐色即为神经元（图1）。(2)钨酸锂对小鼠皮层神经元突起长度和突起数量的影响：①用24孔板培养新生小鼠大脑皮层神经元4 h。②吸出培养液，每孔加入含1％B27的NeurobasalTM培养基390 μl，实验分为8组：空白对照组（加入10 μl PBS溶液）；阳性药对照组：重组人碱性成纤维细胞生长因子（rhbFGF）组（加入rhbFGF，终浓度为20 ng/ml）；氯化锂组（加入氯化锂，其终浓度为1.0 mmol/L）、钨酸钠组（其终浓度为0.3 mmol/L）、氯化锂+钨酸钠组（终浓度分别为：0.1 mmol/L+0.1 mmol/L）；钨酸锂低（0.008 mmol/L）、中（0.04 mmol/L）、高（0.2 mmol/L）三个组；各组终体积均为400 μl。③继续培养48 h，在倒置显微镜（×250）下观察其生长情况，以胞体呈明显光晕、长出突起的神经元为记录对象，每孔随机取5个视野，每组3个复孔，用目镜测微尺随机在每个视野测量15个神经元突起的长度和突起的数目，取均值进行比较，实验至少重复3次。

　　1.3 统计学处理 数据均以x±s表示，使用SPSS 10.0统计软件进行方差分析。

　　2 结果

　　2.1 钨酸锂对M146L细胞毒性测定 实验浓度下，各组OD值分别为：空白对照组0.891±0.038；氯化锂组0.882±0.028；钨酸钠组0.880±0.038；钨酸钠＋氯化锂0.867±0.041；低、中、高浓度钨酸锂组分别为：0.974±0.039、0.861±0.029和0.886±0.034。与空白对照组相比较，低、中、高浓度钨酸锂组和其他各阳性对照组间均无显著性差异（P＞0.05），即各组对M146L细胞活性均无明显影响，不具有细胞毒性作用。

　　2.2 钨酸锂对M146L细胞分泌Aβ142的影响 见表1。氯化锂、钨酸钠、氯化锂+钨酸钠和钨酸锂组对Aβ142分泌均有抑制作用。钨酸锂抑制Aβ142分泌呈一定的量效关系。

　　表1 钨酸锂对M146L细胞分泌Aβ142的影响（略）

　　与空白对照组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01；下表同

　　表2 钨酸锂对培养48 h大脑皮层神经元的影响（略）

　　2.3 钨酸锂对小鼠皮层神经元突起长度和突起数量的影响 如表2所示，rhbFGF组与空白对照组相比，突起数目、突起长度均有显著性增加；氯化锂和钨酸钠组与空白对照组相比突起数目无显著性差异，但氯化锂组与空白对照组相比突起长度有显著性增加；氯化锂＋钨酸钠组与空白对照组相比，突起数目、突起长度均有显著性增加。低浓度钨酸锂组与空白对照组相比，突起数目、突起长度均无显著性差异；中浓度钨酸锂组与空白对照组相比，突起数目无显著性差异，突起长度有显著性增加；而高浓度钨酸锂组与空白对照组相比，突起数目、突起长度均有显著性增加；但高浓度钨酸锂的作用尚不及rhbFGF，但优于除rhbFGF组外的其他各组。新生小鼠大脑皮层神经元经钨酸锂处理48 h后，低浓度钨酸锂组和空白对照组相似，细胞生长较差，以单极、双极神经元为主，突起短，形成密集交叉网络的较少；中浓度钨酸锂组，伸出突起的细胞明显多于空白对照组和低浓度钨酸锂组，且出现三级和多级神经元；高浓度钨酸锂组，存活的神经元较多，以三级和多级神经元为主，突起较长，生长速度较快，进而局部形成网络。见图2。

　　图2 倒置显微镜（×250）下观察各组小鼠培养48 h的大脑皮层神经元生长情况（略）

　　3 讨论
　　
　　目前认为Aβ在AD病理机制中扮演着非常重要的角色。因此阻止Aβ的合成和沉积，促进其代谢的药物在AD治疗中具有很大的潜力〔5〕。Aβ抑制剂有抑制Aβ生成和抑制Aβ聚集两大类〔6〕。细胞凋亡的异常也是AD脑的主要表现，同时，也是引起神经元丢失的主要原因〔7〕。
　　
　　本实验所采用细胞株M146L是同时转染了人类AD两个相关基因（APP和突变型PS1）的CHO细胞，它能过度产生Aβ142，是一较理想的探讨Aβ表达机制的细胞模型。
　　
　　锂为人体非必需微量元素，具有广泛调节生理功能的作用，涉及神经精神、免疫、内分泌、血液等系统〔8〕。研究发现，锂盐可抑制tau蛋白磷酸化﹑稳定微管系统﹑稳定βcatenin以及抗细胞凋亡〔9〕，并可促进体外培养的神经祖细胞的增殖，拮抗谷氨酸盐、糖皮质激素等的抑制增殖作用。另有实验发现，氯化锂可明显促进成年小鼠海马齿状回的细胞增殖与神经元发生，而且新生的神经元与神经胶质细胞比例基本不变。这一结果说明，氯化锂的作用是多方面的，它不仅能增加新生神经元，而且还能促进神经胶质细胞的发生。研究发现，钨酸钠与氯化锂一样，都是GSK3抑制剂，并且和氯化锂合用具有协同作用。同时也有报道，钨酸钠具有低毒性的特点〔3，4〕。
　　
　　本实验室合成的钨酸锂结合了锂盐和钨酸钠各自优势。本研究结果也表明，钨酸锂在试验浓度范围内，与其他阳性药物组作用类似，对M146L细胞无毒性，并对M146L细胞分泌Aβ142有抑制作用。同时，可促进新生小鼠大脑皮层神经元突起数目、突起长度及存活细胞数目增加，减少神经元死亡。因此，钨酸锂有望成为神经退行性疾病如AD的治疗药物。

参考文献

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　　3 GómezRamos A，Domínguez J，Zafra D，et al.Inhibition of GSK3 dependent tau phosphorylation by metals〔J〕. Curr Alzheimer Res，2006；3(2):1237.

　　4 GómezRamos A，Domínguez J，Zafra D，et al.Sodium tungstate decreases the phosphorylation of tau through GSK3 inactivation〔J〕.J Neurosci Res，2006；83(2):26473.

　　5 Tuszynski MH，U HS，Amaral DG，et al.Nerve growth factor infusion in primate brain reduces lesioninduced cholinergic neuronal degeneration〔J〕. J Neurosci，1990；10(11):360414.

　　6 Aisen PS.The development of antiamyloid therapy for Alzheimer′s disease：from secretase modulators to polymerisation inhibitors〔J〕.CNS Drugs，2005；19(12)：98996.

　　7 Loo DT，Copani A，Pike CJ.Apoptosis is induced by betaamyloid in cultured central nervous system neurons〔J〕.Process Nat Acad Sci USA，1993;90（17）:79515.

　　8 张 红.锂的代谢平衡及糖代谢的关系〔J〕.国外医学·生理、病理科学与临床分册，1997；17(4):3161.

　　9 Nishimura M，Yu G，Levesque G，et al.Presenilin mutations associated with Alzheimer disease cause defective intracellular trafficking of betacatenin，a component of the presenilin protein complex〔J〕.Nature Med，1999；5(2):1649.