作者：卢丽 冯霞 徐婷婷 李树峰 佟慧丽 严云勤
摘要Metacaspase是由YCA1/MCA1编码的一种哺乳动物caspases同系物。由于其分子结构的差异，使其断裂为不同的特异性底物。在哺乳动物中，凋亡被一组蛋白酶caspases定向激活，断裂特异性底物且触发细胞死亡。环境损伤、细胞内缺陷、预凋亡基因的异源表达诱导具有典型凋亡特征的酵母细胞死亡与metacaspase紧密相关。删除metacaspase可以阻碍不同因素引起的死亡，metacaspase在酵母细胞凋亡中具有核心作用。关键词酵母;YCA1;凋亡
AbstractMetacaspase is a kind of mammal caspases homolog which coded by the YCA1/MCA1 gene. It can break into different specificity substrates because its difference in molecular structure. In mammals，apoptosis can be activated directly by a group of proteases，called caspases，then cleave specific substrates and trigger cell death. Damaging environment，certain intracellular defects and heterologous expression of pro-apoptotic genes inducing death in yeast cells exhibiting typical markers of apoptosis was closely related with themetacaspase. Metacaspase deletion may hinder the death which was caused by different factors. Metacaspase played a central role in yeast apoptosis progress.
Key wordsyeast;YCA1;apoptosis
细胞凋亡(apoptosis)或编程性细胞死亡(programmed cell death，PCD)是一个高度被协调的细胞自杀过程，其对健康状态的维持和组织功能起决定性作用，细胞凋亡紊乱可导致癌症或神经退行性病变(neurodegenerative disorders)。
细胞有多种死亡方式，细胞凋亡应指仅仅是形态改变的细胞死亡。这些改变包括细胞聚集，细胞体积变小，染色质浓缩，核断裂，胞质细胞器少有或没有超微结构修饰，磷脂酰丝氨酸外翻，质膜起泡和维持质膜完整性直到凋亡晚期。虽然酵母基因组中没有哺乳动物Bax和Bcl家族的基因类似物，但由Bax介导的酿酒酵母细胞死亡具有典型的凋亡特征，如细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸外翻，细胞色素C释放，膜起泡，染色质凝聚和边缘化，DNA断裂。若同时表达Bcl-xL可阻止这些现象发生和细胞死亡[1]。酿酒酵母基因组突变诱导的细胞死亡也具有哺乳动物凋亡细胞的表型特征[2]。酵母细胞死亡涉及的一些基因已被证实为后生动物凋亡调控子。被研究的哺乳动物凋亡级联的一些必要元件的酵母类似物有caspase [3]，Omi [4]，AIF [5] and Endo G [6]，这说明凋亡的基本元素在单细胞有机体中是确实存在并起功能的。随着研究的深入，人们已经认识到，凋亡不仅存在于多细胞生物中，也存在于单细胞真核生物中，近年来，酿酒酵母发生凋亡已被公认。
1Metacaspase
Caspases是一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶。其命名由半胱氨酸依赖天冬氨酸的特异性而来。Metacaspase是caspases和paracaspase的同系物。Uren等通过PSI-BLAST研究发现metacaspase和paracaspase。以前的酵母基因组分析表明其不存在caspase，但通过序列比较发现ORF YOR197w编码一个类caspase蛋白，符合1型metacaspase的被命名为MCA1。后来因为YOR197w可被作为酵母的一个真实的caspase基因并被更名为YCA1[7]。
分子水平的系统进化分析表明，植物、真菌和原生动物的metacaspases 在进化上起源于caspases。酵母YCA1具有caspase的保守结构域。虽然保守，但差异是不可避免的。caspase特异性断裂天冬氨酸，其分为起始caspase(caspase 8， 9，10，12)和效应caspase(caspase 3，6，7)2类，而酵母只有YCA1，其在N末端含有1个富含脯氨酸的区域，酵母中的YCA1被激活起始通过水解掉1个12kDa的小亚基。但酵母的metacaspase和部分植物的metacaspase具有精氨酸、赖氨酸特异性。
虽然酵母YCA1与动物caspase在分子结构和断裂特异性底物上存在一些差异，但它们都介导细胞凋亡过程。YCA1是酵母中迄今发现的仅有的类caspase蛋白，YCA1在外源刺激和内源信号引起的众多凋亡过程中起核心作用。
2生理条件下的酵母凋亡与YCA1的作用
酵母细胞在时序衰老[8]、杀伤毒素产生的生理条件下发生的凋亡需要YCA1。时序衰老死亡的酵母菌显示典型的凋亡特征，如氧自由基的积累和YCA1的活化。通过删除YCA1可增加其长期培养的存活率进而破坏凋亡机制，虽然对整个菌落是不利的[8]。德尔饮食限制一段时间后，即使有可利用的营养，衰老的YCA1缺陷株也不能再生长，使菌落产生严重损伤和大量老细胞。这显示酵母凋亡的生理作用在衰老相关细胞死亡中进行适当细胞的选择起重要作用。对整个种群具有“清洁”效应。
产生杀伤毒素的细胞表型在多种酵母属种中普遍存在，损伤与低分子量蛋白或糖蛋白毒素(杀伤毒素)的分泌相关，其能杀伤敏感的细胞，在第2阶段的受体介导进程中没有细胞间的直接接触。在酵母中发现3个不同的杀伤毒素(K1，K2，and K28)，其由细胞质双链RNA病毒编码，作为分泌α/β毒素的前体。在低浓度下，这3个病毒编码酵母毒素诱导凋亡标志的死亡。酵母YCA1和ROS介导这个过程。相反，高浓度诱导坏死，而不是凋亡，其不依赖YCA1和 ROS[9]。所以，在自然环境中，毒素浓度是低的，杀伤细胞通过诱发凋亡能清除竞争的敏感细胞。
免费论文下载中心
3外源刺激诱导酵母凋亡与YCA1的作用
很多应激条件和药物能够诱导酵母细胞凋亡，其中大部分都需要YCA1的作用。低剂量的h3O2和醋酸是最常见的诱导物[10-11]。删除YCA1的菌株经h3O2处理比野生型存活好，蛋白酶体活力增加，减小凋亡，而过表达YCA1的细胞死亡程度增加且显示凋亡特征，使细胞提早死亡[10]。但经400 mmol/L醋酸诱导的凋亡仅有20%~30%的caspase阳性细胞，说明这个凋亡过程与caspase有较小的相关性[11]。适当的渗透应激可使酵母细胞发生凋亡和YCA1活化，但在YCA1缺陷株中，渗透性应激后仍有微量的metacaspase激活。渗透应激过程中，YCA1激活依赖Sro77p，在缺乏SRO77的突变株中caspase活力与YCA1缺陷株的细胞相似。而Sro77p同系物Sro7p，对YCA1激活起负向作用[12]，但盐敏感的Sro7p突变株中caspase活力比野生型高。且sro77/yca1 和 sro7/sro77/yca1突变株，仍然显示凋亡特征，这都显示有不依赖YCA1的凋亡路径存在。
YCA1缺陷株经25 mmol/L丙戊酸(VPA)处理具有90%的存活率，这个浓度使野生型细胞完全致死[13]。有毒非金属砷处理后的酵母细胞存活率YCA1缺陷株(91.3%)比野生株(50.3%)高。此外，经TUNEL染色确定DNA断裂率在突变株(1.5%)中显著高于野生株(34.3%)[14]。而暴露于高水平的锰(Mn)中，可致使锰中毒，Mn2+诱导的细胞凋亡通过caspase途径[15] 。但铜诱导的凋亡不涉及YCA。咖啡因对预凋亡突变株(Kllsm4Δ1)敏感，并被同时失活的YCA1抑制[16]。
4内源诱导酵母凋亡与YCA1的作用
酵母凋亡首先被描述在CDC48基因突变细胞中，其编码AAA-ATPase，对细胞分裂、泛素依赖的内质网相关蛋白降解和囊泡运输起作用。在cdc48S565G突变细胞中caspase活力增加，暗示在这个突变株中，YCA1被激活[17]。缺乏功能性细胞色素C的突变株△cyc1△cyc7和△cyc3与野生型相比，有caspase活力的细胞减少且增加存活率[18]。其他突变株也显示凋亡表型，其中大部分YCA1作为突变诱导细胞死亡的执行者。YCA1激活也与众多的细胞基本进程缺陷相关，如DNA复制，线粒体功能，RNA和蛋白稳定。
4.1DNA复制
当由DNA损伤药物阿多来新诱导酵母以蛋白酶体依赖方式进行凋亡时，Cdc6p(DNA复制起始必需的预复制复合物元件)很快被降解[19]。ORC2编码ORC和orc2-1突变细胞的一个亚基，在非许可温度，DNA复制起始缺陷，激活DNA损伤并凋亡[20]。Orc2-1细胞凋亡诱导活性氧(ROS)产生和YCA1激活，促成orc2-1突变体死亡。ROS和YCA1的激活可能由与DNA复制叉崩溃相关的DNA损伤所诱导[20]。
4.2mRNA稳定
在酵母中，mRNA翻译至少沿行3个蜕变路径。其中2个是mRNAs的5′/3′核酸外切消化紧跟着一个脱盖事件，第3个路径中，转录物经3′/5′核酸外切消化被降解。在脱帽依赖路径，mRNAs在特定的细胞质位置被降解，叫P-体，在生长过程和细胞应激后，其大小和数量改变。P-体元件(dcp1，dcp2，dhh1，lsm1-7)突变显示凋亡表型和加速时序衰老。至少其中一个突变(Kllsm4Δ1)中，凋亡死亡依赖YCA1活力，lsm4Δ1/yca1Δ双突变凋亡细胞减少，时序衰老过程中生存力增加[16]。
4.3蛋白稳定性
蛋白的翻译后修饰被泛素(Ub)共价附着，这是调控细胞死亡程序的一个主要生物机制。在酵母中，泛素化与凋亡相关。事实上，通过蛋白酶体使内质网相关蛋白降解和Stm1p积聚时，需要Cdc48p，它是一种蛋白酶体底物，特异性诱导细胞死亡，当细胞缺乏Stm1p经氧化氢诱导凋亡后显示高存活率。而UBP10的缺失，会导致细胞过早死亡，可通过删除YCA1有效地援救此行为[21]。
5外源凋亡蛋白表达与YCA1的作用
哺乳动物凋亡蛋白在酵母中的异源表达显示凋亡的特征，说明在酵母中有一个保守的细胞死亡程序。
仅仅caspase 8在酵母中的过表达致使细胞死亡，而caspase 3的过表达不能致死仅能抑制酵母生长。后生动物(人类，果蝇和线虫)caspases的异源表达使酵母的原生质和核膜断裂致使电势降低，没有损坏DNA。但异源caspases的作用不需要酵母凋亡自身调控者YCA1和AIF1。此外，YCA1或AIF1的缺失并没有导致保护预凋亡蛋白Bax诱导的毒力[22-23]，所以在这里，细胞死亡可能通过自体吞噬发生。
植物和原生动物诸虫的metacaspases在酵母中表达时，其中一些能补偿YCA1的缺失。如拟南芥的2个metac-aspases(AtMCP1b and AtMCP2b)在yca1突变细胞中表达被证实在衰老过程和氧化应激诱导凋亡中被涉及[24]。来自寄生虫硕大利什曼原虫的单个metacaspase基因在YCA1无效突变细胞中表达能修复酵母细胞对氧化应激的敏感性，成活率水平和凋亡特征与有YCA1补助的突变细胞相似[25]。
酵母也是研究有丝分裂细胞的衰老相关退化的有用模型，如烟胺比林病理学。烟胺比林蛋白α结瘢(alpha-syn)是连接帕金森病(PD)因素之一。酵母细胞表达alpha-syn积累脂滴，显示空泡、溶酶体缺损并显示凋亡标志，包括磷脂酰丝氨酸外翻，细胞色素c释放和活性氧的积累。YCA1基因的删除废止alpha-syn诱导的ROS积累并促进alpha-syn-表达细胞的强力生长。这些研究表明，alpha-syn-诱导的ROS产生由caspase介导，并指出alpha-syn的表达激活caspase活力，然后刺激ROS的产生并触发凋亡[26]。
亨延顿舞蹈病由亨廷顿蛋白的特异性突变引起。亨廷顿一个聚谷氨酸(polyQ)重复扩大导致神经元中蛋白聚集，紧接着有凋亡标志的细胞死亡。在酵母中存在类似的情况，在核子中扩大polyQ聚集物积累并诱导线粒体断裂，caspase激活和细胞死亡。虽然YCA1的缺失没有显著营救菌落生长中polyQ的有害效应，但聚集体的细胞内定位被强烈影响，缺失型突变体比野生型有四倍体的核定位。
6酵母凋亡过程中YCA1的分子机制
哺乳动物中，死亡受体通路和线粒体通路是导致依赖caspase凋亡的主要途径。激活起始caspase，紧接着激活效应caspase，最后切断细胞死亡必要的底物。caspase蛋白家族一旦被激活后便不可逆地启动细胞死亡的执行阶段。
在酵母中还没有发现死亡受体相关类似物，但YCA1起着经典的起始caspase作用。只有人类caspase 8在酵母中异源表达有毒力，而其他的caspase异源表达无毒力。其高效断裂对于caspase 8有高效特异性的IETD-AMC底物，而不能断裂效应caspase3特异底物DEVD-AMC。但DEVD-VAD抑制由h3O2诱导的fis1突变株死亡，指出YCA1活力也与效应caspases相似(主要caspase3和7)。
在线粒体通路过程中，哺乳动物释放的细胞色素C与Apaf1结合使其寡聚化，随后pro-caspase-9复原并活化，形成的复合物被称为“apoptosome”。caspase激活需要细胞色素C已经被很好的论证。酵母中细胞色素C的释放最先在细胞中表达人预凋亡蛋白Bax被证实的。基于Bax表达，细胞色素C氧化酶减少和大量细胞色素C释放到细胞质中。删除酵母中编码细胞色素C的2个亚型的基因虽不能废止死亡，但能推迟酵母细胞应对一些死亡刺激[27]。
由aac1/2/3编码的ADP/ATP 携带(AAC)蛋白突变株中过表达yca1并不能增加细胞死亡，因为没有细胞色素C的释放。高葡萄糖或山梨醇的培养基导致线粒体膨胀和细胞色素C释放，伴随caspase 活力增加和细胞死亡。删除YCA1显著营救这些表型。突变株△cyc1△cyc7和△cyc3与野生型相比，caspase活力细胞减少且存活率增加[27]。这些发现支持在酵母YCA1激活中涉及线粒体和细胞色素C的后继活力。然而在酵母中没有发现哺乳动物凋亡相关因子Apaf1的同源物和相似功能的蛋白，所以酵母中细胞色素C释放的上游机制及其如何激活YCA1仍不清楚。
与细胞色素C释放无关的死亡通路在哺乳动物中存在且涉及EndoG和AIF1，凋亡刺激后，这2个核酸酶从线粒体定位到核中。酵母中有编码这些蛋白的基因同源物，分别为NUC1(YJL208c)and YNR074c，这可能阐明细胞色素C和YCA1不相关的凋亡途径[5-6]。
由过氧化氢或醋酸处理引起的酵母细胞死亡，Dnm1p启动线粒体断裂，进而发生细胞凋亡。删除线粒体裂变因子FIS1可诱导细胞死亡，但删除yca1可以废除其作用[28]。
7结语
酵母凋亡过程的保守性及其在分子生物学研究方面的先天优势，成为凋亡研究新的模式生物。YCA1是哺乳动物caspase的垂直同源物，在酵母细胞凋亡中具有核心作用，外源刺激，氧化压力、衰老等多种因素导致的细胞凋亡过程中，干扰YCA1 均能避免形成凋亡表型由YCA1介导的且与线粒体相关的细胞死亡，与后生动物的内在凋亡路径如出一辙。但含有重组体YCA1的细菌浸液显示精氨酸、赖氨酸特异的半胱氨酸肽链内切酶活力，且其不被caspase z-VAD-fmk的抑制剂抑制[24]，这个表示YCA1具有一个不同于后生动物caspase的特异性位点。此外，酵母基因组可能含有除了YCA1的其他metacaspases，它们可能不能断裂普遍被识别的caspase底物，而由其他的细胞死亡调节器起作用。
YCA1在凋亡过程中的作用及其分子机制既有保守的一面也有复杂的一面，不同的生长条件下YCA1是怎样影响基因表达和细胞代谢仍不清楚，它的上下游通路及其作用的具体机制还不是很清楚，所以YCA1其相关物质的发掘与作用还需要更深入的研究，这样会更了解酵母凋亡路径和，对比高等真核生物研究，为其他物种的研究做出指导。
8
参考文献
[1] LIGR M，MADEO F，FROHLICH E，et al. Bax triggers apoptotic changes in yeast[J].FEBS Lett，1998(438):61-65.
[2] FROHLICH K U，FUSSI H，RUCKENSTUHL C.Yeast apoptosis-from genes to pathways[J].Semin. Cancer Biol，2007(17):112-121.
[3] MADEO F，HERKER E，MALDENER C，et al. A caspase-related prot-ease regulates apoptosis in yeast[J].Mol. Cell，2002(9):911-917.
[4] FAHRENKROG B，SAUDER U，AEBI U.The S. cerevisiae HtrA-like protein Nma111p is a nuclear serine protease that mediates yeast apoptosis[J].J Cell Sci，2004(117):115-126.
[5] WISSING S，LUDOVICO P，HERKER E，et al. An AIF orthologue regu-lates apoptosis in yeast[J]. J Cell Biol，2004(166):969-974.
[6] BUTTNER S，EISENBERG T，CARMONA-GUTIERREZ D，et al. End-onuclease G regulates budding yeast life and death[J]. Mol Cell，2007(25):233-246.
[7] UREN A G，O'ROURKE K，ARAVIND L A，et al. Identification of para-caspases and metacaspases:two ancient families of caspase-like proteins，one of which plays a key role in MALT lymphoma[J]. Mol Cell，2000(6):961-967.
[8] HERKER E，JUNGWIRTH H，LEHMANN K A，et al. Chronological aging leads to apoptosis in yeast[J]. J Cell Biol，2004(164):501-507.
[9] REITER J，HERKER E，MADEO F，et al. Viral killer toxins induce caspase mediated apoptosis in yeast[J].J Cell Biol，2005(168):353-358.
[10] MADEO F，FROHLICH E，LIGR M，et al. Oxygenstress: a regulator of apoptosis in yeast[J].J Cell Biol，1999(145):757-767.
[11] GUARAGNELLA N，PEREIRA C，SOUSA M J，et al. Giannattasio，YCA1 participates in the acetic acid induced yeast programmed cell death also in a manner unrelated to its caspase-like activity[J]. FEBS Lett，2006(580):6880-6884.
[12] WADSKOG I，MALDENER C，PROKSCH A，et al. Yeast lacking the SRO7/SOP1-encoded tumor suppressor homologue show increased susceptibility to apoptosis-like cell death on exposure to NaCl stress[J]. Mol Biol Cell，2004(15):1436-1444.
免费论文下载中心
[13] MITSUI K，NAKAGAWA D，NAKAMURA M，et al. Valproic acid indu-ces apoptosis dependent of Yca1p at concentrations that mildly affect the proliferation of yeast[J]. FEBS Lett，2005(579):723-727.
[14] DU L，YU Y，CHEN J，et al. Arsenic induces caspase- and mitoc-hondria-mediated apoptosis in Saccharomyces cerevisiae[J]. FEMS Yeast Res，2007(7):860-865.
[15] LIANG Q，ZHOU B.Copper and manganese induce yeast apoptosis via different pathways[J].Mol Biol Cell，2007(18):4741-4749.
[16] HE Z，MA W Y，HASHIMOTO T，et al. Induction of apoptosis by caff-eine is mediated by the p53，Bax，and caspase 3 pathways[J]. Cancer Res，2003(63):4396-4401.
[17] BRAUN R J，ZISCHKA H，MADEO F，et al. Ueffing，Crucial mito-chondrial impairment upon CDC48 mutation in apoptotic yeast[J].J Biol Chem，2006(281):25757-25767.
[18] SILVA R D，SOTOCA R，JOHANSSON B，et al. Hyperosmotic stress induces metacaspase-and mitochondria dependent apoptosis in Saccharomyces cerevisiae[J]. Mol Microbiol，2005(58):824-834.
[19] CERVENY K L，TAMURA Y，ZHANG Z，et al. Regulation of mitoch-ondrial fusion and pision[J]. Trends Cell Biol，2007(17):563-569.
[20] WEINBERGER M，RAMACHANDRAN L，FENG L，et al. Apoptosis in budding yeast caused by defects in initiation of DNA replication[J].J Cell Sci，2005(118):3543-3553.
[21] BETTIGA M，CALZARI L，ORLANDI I，et al. Involvement of the yeast metacaspase Yca1 in ubp10 Delta-programmed cell death[J]. FEMS Yeast Res，2004(5):141-147.
[22] GUSCETTI F，NATH N，DENKO N. Functional characterization of human proapoptotic molecules in yeast S. cerevisiae[J]. FASEB J，2005(19):464-466.
[23] KISSOVA I，PLAMONDON L T，BRISSON L，et al. Evaluation of the roles of apoptosis，autophagy，and mitophagy in the loss of plating effi-ciency induced by Bax expression in yeast[J]. J Biol Chem，2006(281):36187-36197.
[24] WATANABE N，LAM E. Two Arabidopsis metacaspases AtMCP1b and AtMCP2b are arginine/lysine-specific cysteine proteases and activate apoptosis-like cell death in yeast[J].J Biol Chem，2005(280):14691-14699.
[25] GONZALEZ I J，DESPONDS C，SCHAFF C，et al. Leishmania major metaca-spase can replace yeast metacaspase in programmed cell death and has arginine-specific cysteine peptidase activity[J]. Int J Parasitol，2007(37):161-172.
[26] FLOWER T R，CHESNOKOVA L S，FROELICH C A，et al. Heat shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of Parkinson's disease[J]. J Mol Biol，2005(351):1081-1100.
[27] SILVA R D，SOTOCA R，JOHANSSON B，et al. M. Corte-Real，Hyperosmotic stress induces metacaspase- and mitochondria dependent apoptosis in Saccharomyces cerevisiae[J]. Mol Microbiol，2005(58):824-834.
[28] FANNJIANG Y，CHENG W C，LEE S J，et al. Mitochondrial fission proteins regulate programmed cell death in yeast[J]. Genes Dev，2004(18):2785-2797.