SurvivinsiRNA真核重组质粒的构建和鉴定及其对前列腺癌DU145细胞的影响

　　　　　　 作者：刘艳波 葛贺 卢丽莉 赵雪俭

【摘要】 目的 应用RNA干扰(RNAi)技术，构建针对凋亡抑制因子survivin的siRNA，并检测其对DU145细胞株内源性survivin基因和蛋白表达的影响。方法 构建重组质粒shRNAsur1和sur2并分别转染 DU145细胞株，通过半定量 RTPCR和Western印迹检测survivin mRNA转录水平和蛋白表达的变化。结果 成功构建针对survivin干扰的两种真核表达质粒;两种重组质粒shRNAsur1和sur2均能明显抑制内源性survivin基因表达，其抑制率分别为72%±8%和77%±5%;两种质粒均能明显抑制survivin蛋白的表达，其抑制率分别为75%±8%和80%±6%。结论 重组质粒shRNAsur1和sur2均可明显抑制DU145细胞内源survivin 蛋白表达和mRNA转录，为survivin介导的肿瘤基因沉默提供良好的基础。

【关键词】 siRNA;DU145细胞株;survivin 基因;质粒

survivin是1997年发现的凋亡抑制蛋白(IAPs)家族的一个新成员，仅特异性表达于人和鼠胚胎发育组织及多数人类肿瘤组织，在正常成人组织几乎不表达〔1〕。有研究表明：survivin基因在前列腺癌中高表达，其在前列腺组织中再激活和异常表达而导致细胞凋亡减少，参与了前列腺癌发生、发展，survivin蛋白表达和前列腺癌细胞凋亡呈负相关〔2〕。使得应用RNA干涉技术沉默Survivin基因成为可能。小干扰 RNA (siRNA) 技术是目前简单而高效阻断哺乳动物细胞内特异基因表达的最有效方法。本实验选择和设计针对survivin基因siRNA靶序列，通过人工合成靶序列后构建表达siRNA靶序列载体，并转染前列腺癌DU145细胞，观察siRNA能否诱导DU145细胞内源性survivin表达沉默，为体内外实验提供实验基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 人激素非依赖性前列腺癌DU145细胞株，为吉林大学前列腺疾病防治研究中心传代保存;大肠杆菌JM109为本中心保存;质粒pGCsiU6/Neo/GFP购自上海吉凯基因化学有限公司;各种分子克隆工具酶为TaKaRa产品，DNA纯化试剂盒、RTPCR试剂盒、去内毒素质粒DNA小量提取试剂盒和小量DNA切胶回收纯化试剂盒为上海华舜生物工程有限公司产品;IMDM培养基为美国Hyclone公司生产，新生牛血清购自北京鼎国公司;转染试剂Lipofectamin2000购自Invitrogen公司，兔抗人survivin抗体及羊抗兔二抗购自Santa Cruz公司，蛋白定量试剂盒为BioRad公司产品;其他试剂为进口或国产分析纯。DNA片段及序列测定均由上海生工生物公司完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 Survivin siRNA模板寡核苷酸设计 按siRNA设计原则，从GeneBank(NM001168)中寻找符合survivin mRNA特异靶序列，并用RNA structure4.2软件对其二级结构进行预测，最终确定了两条DNA 寡核苷酸链：(1)shRNAsur1针对其编码区166～184位碱基序列，其对应开放阅读框架序列为45～63;核苷酸序列为5′GATCCCGGACCACCGCATCTCTACATTCAAGAGATGTAGAGATGCGGTGGTCCTTTTTGGAT3′(正义)，5′AGCTA TCCAAAAAGGACCACCGCATCTCTACATCTCTTGAATGTAGAGATGCGGTGGTCC GG3′ (反义);(2)shRNAsur2针对其编码区394～412位碱基序列，其对应开放阅读框架序列为273～291，5′GATCCCGCAGTTTGAAGAATTAACC TTCAAGAGA GGTTAATTCTTCAAACTGCTTTTTGGAT3′( 正义)，5′AGCTA TCCAAAAAGCAGTTTGAAGAATTAACC TCTCTTGAA GGTTAATTCTTCAAACTGC GG3′ (反义)每条正义链包括5′末端BamH Ⅰ酶切位点和反向的两个一致的靶序列(19 bp)，两个靶序列之间被9个非同源序列(TTCAAGAGA)所间隔。3′末端加有TTTTT以及Hind Ⅲ酶切位点;同时设计对照质粒，5′GATCCGTATAAGTCAACTGTTGAC TTCAAGAGA GTCAACAGTTGACTTATACTTTTTTGGAAA3′(正义)，5′AGCTTTTCC AAAAAAGTATAAGTCAACTGTTGACTCTCTTGAAGTCAACAGTTGACTTATACG3′(反义)由上海生工公司合成。

　　1.2.2 构建重组质粒pGCsilencerU6siRNAsurvivin 首先将pGCsilencerU6/Neo/GFP质粒用BamH Ⅰ及Hind Ⅲ消化，凝胶回收pGCsilencer线性化片段(图1);将上述合成的正义和反义的寡聚核苷酸片段等比例混合后经过 93℃变性 3 min后退火60 min 得到双链寡聚核苷酸片段，利用 T4 DNA 连接酶分别与上述线性化表达载体连接，构建siRNA表达重组载体shRNAsur1 和sur2。

　　1.2.3 细胞培养 DU145 细胞株常规培养于含10%新生牛血清、100 U/ml 青霉素、100 U/ ml 链霉素的IMDM培养液中，培养条件为 37℃、CO2饱和度为5%，定期观察细胞生长情况，每 2～3 d用0.25%胰酶消化，进行传代培养。

　　1.2.4 转染细胞 应用小量质粒提取试剂盒，提取去内毒素重组质粒shRNAsur1、sur2和scramble，并使用D(λ) 值进行 DNA 定量。正常培养的DU145细胞融合至70%～80%时转染，用Invitrogen 公司转染试剂 LipofectamineTM2000进行转染。并分组为脂质体组、空质粒pGCsiU6/Neo/GFP、非特异对照组pGCsiscramble、pGCsisur1、sur2。 除脂质体组外均按Invitrogen 转染试剂盒说明进行操作置 37℃培养，4～6 h 后加入含 10%血清的IMDM培养液，置 37℃培养，转染72 h后收集细胞进行转染效率检测。

　　M.DNA marker;1.pGCsilencerU6/Neo/GFP;2.经BamHⅠ和HindⅢ酶切的pGCsilencerU6/Neo/GFP

　　图1 pGCsilencerU6/Neo/GFP 质粒酶切鉴定

　　1.2.5 半定量 RTPCR分析细胞survivin基因的表达 转染72 h后用 0.25%的胰酶消化，分别收集各组细胞，利用Trizol试剂提取DU145细胞总RNA，半定量RTPCR扩增目的基因survivin和内参基因βactin。反应体系中加入两对引物，第一对是survivin基因引物，即 5′GAATTCATGGGTGCCCCGACGTTGCC3′和5′AGATCTTTCTTCTTATTGTTGGTTTCC3′，扩增片段长度为415 bp。第二对是βactin基因引物，即5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′和5′CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′，扩增片段长度为630 bp。PCR反应条件：94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 60 s，30个循环后，72℃延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下拍照。

　　1.2.6 Western印迹分析细胞survivin蛋白含量 转染72 h后收集细胞提取总蛋白，用Bradford法进行定量，取50 μg蛋白进行10%SDSPAGE凝胶电泳分析，电泳结束后转移蛋白至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入1∶200稀释的兔抗人survivin一抗，室温作用3 h，TBST洗膜，加入1∶2 000稀释的羊抗兔IgG/HRP，室温温育1 h，TBST洗膜，用DAB显色。

　　1.3 统计学分析 数据均以x±s表示，采用SPSS11.0软件进行t检验和方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 pGCsilencerU6siRNAsurvivin重组质粒的鉴定 将重组质粒转化感受态细胞JM109，筛选阳性质粒，小量提取，进行电泳(图2)用HindⅢ酶切鉴定，不能切开者为阳性重组质粒(图3)。 阳性克隆经cDNA序列测定，DNA测序结果证实shRNAsur1、sur2和scramble片段与pGCsilencerU6/Neo/GFP质粒连接正确，两个pGCsisur和pGCsiscramble重组质粒构建成功。

　　2.2 转染效率检测 构建的psiScramble，psiSurvivin重组质粒均携带绿色荧光蛋白基因，转入DU145细胞后表达绿色荧光蛋白。psiSurvivin组在荧光显微镜下可观察到绿色荧光，转染效率为75.2%±4.37%，而模拟组未见绿色荧光(图4)。

　　M.DL1500 Marker;1.pGCsilencerU6/Neo/GFP;2.pGCsisur1;3.pGCsisur2;4.pGCsiscramble

　　图2 pGCsisur重组质粒的鉴定M.DNA Marker;1.pGCsilencerU6/Neo/GFP;2.经HindⅢ酶切的pGCsilencerU6/Neo/GFP;3.pGCsisur1 重组质粒;4.经HindⅢ酶切的pGCsisur1重组质粒;5.pGCsisur2重组质粒;6.经HindⅢ酶切的pGCsisur2重组质粒;7.pGCsiscramble重组质粒;8.经HindⅢ酶切的pGCsiscramble

　　图3 pGCsisur重组质粒的酶切鉴定结果图4 荧光显微镜检测转染效率(×400)

　　2.3 siRNA抑制转染细胞survivin mRNA水平 转染后72 h提取细胞总RNA，利用半定量RTPCR方法检测survivin基因转录水平(图5)。运用GIS凝胶分析软件光密度扫描分析，以脂质体组survivin基因表达产物与内参βactin产物的电泳亮度比值定为1，则其他各组的比值分别为：pGCsiU6/Neo/GFP空质粒1.02±0.15(n=3); pGCsiscramble对照组为0.93±0.18(n=3);pGCsi sur1为0.27±0.08(n=3); pGCsi sur2为0.23±0.05(n=3)。空质粒组和pGCsiscramble组与脂质体组比较无差别(P>0.05)，pGCsisur1和pGCsisur2组亮度明显减弱(P<0.05)，结果表明重组质粒pSisur在mRNA水平上抑制了survivin基因转录。

　　M.Marker;1.liposome;2.pGCsilencerU6/Neo/GFP;3.pGCsiscramble;4.pGCsi sur1;5.pGCsisur2

　　图5 pGCsisur抑制DU145细胞 survivin mRNA和蛋白表达结果2.4 siRNA抑制细胞中survivin蛋白表达 转染72 h后提取细胞总蛋白进行Western印迹分析(图5)。光密度扫描分析以脂质体组的survivin与内参βactin的杂交带亮度比值定为1，则其他各组的比值分别为：pGCsiU6/Neo/GFP空质粒1.10±0.20(n=3); pGCsiscramble对照组为1.03±0.12(n=3);pGCsi sur1为0.25±0.08(n=3); pGCsi sur2为0.20±0.06(n=3)。空质粒组和pGCsiscramble组与脂质体组比较无差别(P>0.05)，实验组细胞的survivin蛋白表达受到了明显抑制(P<0.05)。Western印迹结果进一步证实了构建的siRNA质粒可在蛋白水平上抑制survivin表达。

　　3 讨 论

　　survivin具有高度保守性和调节细胞分化、抑制凋亡的功能。在结肠癌、 直肠癌、 乳腺癌、 非小细胞肺癌、 前列腺癌、胃癌以及神经母细胞瘤的研究提示survivin的表达可作为预后不良的标志〔3～6〕。有证据显示survivin是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子之一，抑制肿瘤细胞survivin的功能可以促进肿瘤细胞凋亡而起到治疗肿瘤的作用。研究证明:survivin在肿瘤组织的高表达和表达的特异性使其成为目前恶性肿瘤诊断和治疗的新靶点。人工合成的survivin反义寡核苷酸、反义RNA、核酶和负显性突变体导入肿瘤细胞内能抑制survivin基因的表达，促进肿瘤细胞凋亡〔7，8〕。

　　RNAi是近几年来发现的抑制基因表达的新兴生物技术。 它是将与目的基因 mRNA序列互补的小的双链RNA 导入靶细胞促使mRNA降解从而高效特异地阻断体内特定基因表达。在细胞内具有3′端两个核苷酸突出末端的19～23nt的小分子干扰核糖核酸siRNA 或短发夹RNA(shRNA)作为RNAi的中介分子，通过序列互补配对法则特异性降解目的基因，具有高度特异性、作用效率高和干扰作用可扩散的特点，具有很强的抑制目的基因的作用。Elbashir〔9〕等发现，用21 bp的dsRNA转染细胞，可特异抑制与之有同源序列的靶基因mRNA表达。siRNA可作为引物使mRNA转变成dsRNA，新生的dsRNA被降解，从而在消除靶mRNA的同时产生更多的siRNA，这些siRNA又可使更多的靶mRNA转变成dsRNA，如此构成一个循环。由于RNAi过程中存在一个RNA指导的RNA多聚酶链反应(PCR)增强了RNAi的基因监视能力，所以少量的siRNA就可触发高效的基因干扰效应，同时确保RNAi机制仅作用于mRNA水平。由于本实验利用DNA载体在细胞内转录mRNA而发挥作用，克服了合成RNA成本高、费用大的缺点，更利于RNAi技术的推广利用。

　　本实验中，采用的是siRNA表达载体法，用带有U6启动子的pGCsiU6/Neo/GFP质粒载体，经带有shRNA模板的DNA寡核苷酸链，退火，插入pGCsiU6/Neo/GFP质粒载体中，该载体附有U6启动子，属于RNA聚合酶Ⅲ启动子，可以在细胞内转录生成shRNA，shRNA在胞内经RNaseⅢ切割成siRNA而发挥作用。另外，该载体带有EGFP绿色荧光，可以方便进行转染率测定。siRNA表达载体的优点在于载体转染细胞后，能够在细胞中持续抑制目的基因表达。另外，由于质粒可以大量复制及扩增，这种方法大大降低了进行RNAi试验成本。

　　到目前为止，有关应用RNAi技术用于DU145细胞而抑制survivin基因表达的报道甚少，本研究是在已构建针对survivin基因的siRNA的基础上，观察其特异性抑制DU145细胞内源目的基因survivin的作用。从结果上看，重组质粒pshRNAsurvivin1和2不仅能明显抑制目的因survivin mRNA的转录和蛋白的翻译，而且非特异对照质粒对survivin基因无抑制作用，表明重组质粒pshRNAsurvivin1和2具有特异性抑制目的基因的作用。总之，本实验结果表明重组质粒pshRNAsurvivin1和2均可明显抑制DU145细胞内源survivin的表达，为survivin介导的肿瘤基因沉默疗法提供良好的实验基础。

参考文献

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　　3 Rdel F，Frey B，Leitmann W，et al.Survivin antisense oligonucleotides effectively radiosensitize colorectal cancer cells in both tissue culture and murine xenograft models〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2008;71(1):24755.

　　4 Moriai R，Tsuji N，Moriai M，et al.Survivin plays as a resistant factor against tamoxifeninduced apoptosis in human breast cancer cells〔J〕. Breast Cancer Res Treat，2009;117(2):26171.

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　　7 Lu B，Mu Y，Cao C，et al.Survivin as a therapeutic target for radiation sensitization in lung cancer〔J〕.Cancer Res，2004;64(8):28405.

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　　9 Elbashir SM，Harborth J，Tuschl T，et al.Duplexes of 21nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells〔J〕. Nature，2001;411(6836)：4948.