丹酚酸B干预内皮祖细胞对骨髓间充质干细胞向心肌分化早期基因表达的影响

　　　　 作者：李庆雯 谭俊珍 南亚昀 范英昌

【摘要】 目的 探讨中药丹酚酸B预处理的内皮祖细胞（EPCs）对急性心肌梗死(AMI)大鼠移植骨髓间充质干细胞（BMSCs）向心肌分化早期基因表达的影响。方法 密度梯度离心法和贴壁筛选法培养、纯化EPCs与BMSCs；免疫细胞化学法（CD34/CD133/CD44）分别鉴定两种细胞。结扎大鼠左冠状动脉，制作大鼠AMI模型，42只大鼠随机分为假手术组，模型组，BMSCs组，EPCs+BMSCs组，其中治疗组用丹酚酸B最佳药物浓度处理的EPCs与BMSCs混合，在大鼠AMI区周边分五点注射。RTPCR检测心肌分化早期基因Nkx2.5、GATA4表达。结果 细胞移植4 w后，EPCs+BMSCs组心肌Nkx2.5、GATA4表达量分别为2.256±0.524和1.567±0.287，与对照组比较差异显著。结论 丹酚酸B预处理的EPCs联合BMSCs的移植上调了BMSCs向心肌分化过程中Nkx2.5、GATA4基因的表达，对心肌细胞的数量增加有重要影响，从而有可能改善心功能。

【关键词】 丹酚酸B；急性心肌梗死；内皮祖细胞；骨髓间充质干细胞；细胞移植

　　【Abstract】 Objective To investigate the effect of salvianolic acid B preconditioned endothelial progenitor cells combined with bone mesenchymal stem cells on gene expression in rats′ models of acute myocardial infarction(AMI). Methods Cultivation and purification of EPCs and BMSCs in vitro were by densitygradient centrifugation and plastic adherence method， and were identified by immunofluorescence and immunocytochemistry (CD34/CD133/CD44). The rat model of AMI was produced by ligation of the coronary artery. 42 rats were pided randomly by model， sham， BMSCs and EPCs combined with BMSCs groups， and EPCs preconditioned with salvianolic acid B combined with BMSCs were injected into the five points of heart ischemia area. After 4 weeks， the expression of Nkx2.5， GATA4 were examined by realtime PCR. Results The expression of NKx2.5 and GATA4mRNA were 1.700±0.382 and 1.135±0.257 respectively， which increased remarkably compared with control group. Conclusions The EPCs preconditioned with salvianolic acid B combined with BMSCs transplantation can increase the expression of NKx2.5 and GATA4， which improve the cardiac function.
　　
　　【Key words】 Salvianolic acid B (SalB); Endothelial progenitor cells (EPCs); Bone mesenchymal stem Cells (BMSCs); Acute myocardialin infarction (AMI)

　　移植的干细胞能在受损心肌部位分化成为新的心肌样细胞〔1，2〕，而骨髓间充质干细胞（BMSCs）因自体来源，取材容易，扩增能力强，成为研究热点。目前研究主要集中在通过药物诱导来提高间充质干细胞（MSCs）移植后的存活和定向分化〔3，4〕。本文前期的研究结果表明丹酚酸B(SalB)可以减小心肌梗死的面积〔5〕，促进心脏功能的恢复。内皮祖细胞(EPCs)是血管内皮的前体细胞，移植后促进缺血性疾病的血管再生和侧支循环建立已被证明〔6〕。因此本文采用SalB预处理EPCs，与BMSCs联合移植，观察急性心肌梗死（AMI）大鼠模型BMSCs向心肌细胞分化过程中早期基因Nkx2.5、GATA4的表达情况。

　　1 资料与方法

　　1.1 材料 LDMEM (美国Gibco公司)；特级胎牛血清（美国Hyclone公司）；血管内皮生长因子（VEGF），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），纤维连接蛋白(R＆D公司)；大鼠单个核细胞分离液（天津灏洋）；5％CO2恒温培养箱（model TC2323 CO2 incubator）；CD34兔多克隆抗体，CD44兔多克隆抗体(武汉博士德），CD133兔多克隆抗体（天津灏洋）；SalB（天津天士力现代中药资源有限公司，批号20060601）；ABI7300实时定量PCR仪；逆转录试剂盒、SYBR(R) Premix Ex TaqTM（宝生物工程（大连）有限公司）；Trizol总RNA提取试剂（天津润泰科技发展有限公司）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 EPCs培养与鉴定 贴壁培养和密度梯度离心结合法：雄性Wistar大鼠，脱颈处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，DHank液冲洗骨髓，筛网过滤，将大鼠单个核细胞分离液（密度为1.080 g/ml）预先置于试管的底部，按照1∶1的比例缓慢滴加骨髓悬液，离心（2 000 r/min，15 min），抽取位于界面层灰白色的单个核细胞，用DHank离心洗涤后，以2.0×105/cm2的密度接种于纤维连接蛋白(5 μg/cm2)的包被的培养瓶中，LDMEM（含体积分数为15%胎牛血清，15%VEGF，15% bFGF），置于37℃，5% CO2饱和湿度的培养箱中培养，4 d后首次换液，继续培养至第7天。选取生长良好的培养至7 d的EPCs，用SABC法检测细胞表面抗原CD34、CD133。CD34、CD133定位于细胞膜及细胞质。以细胞膜和细胞质出现棕黄色、高出背景色者为阳性细胞。

　　1.2.2 BMSCs培养与鉴定 贴壁培养和密度梯度离心结合法：雄性Wistar大鼠，脱颈处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，DHank液冲洗骨髓，筛网过滤，将percoll细胞分离液（密度1.073 g/ml）预先置于试管的底部，按照1∶1的比例缓慢滴加骨髓悬液，离心（1 800 r/min，20 min），收获位于界面层灰白色的单个核细胞，用DMEM离心洗涤后以3.0×105/cm2的密度接种于DMEM（含10%胎牛血清），置于37℃，5% CO2饱和湿度的培养箱中继续培养，48 h后首次换液，以后每3 d更换一次培养液。2 w后，细胞长满80%瓶底。BMSCs表达CD44，但不表达CD34。

　　1.2.3 MTT方法检测SalB的最佳药物浓度 设立SalB浓度为0，0.25，0.5，1，2，4，8，16，32，64 μg/ml共10组，MTT方法分别测定细胞的吸光度（OD）值，根据OD值均数确定SalB的最佳药物浓度。

　　1.2.4 大鼠AMI模型的制作 冠状动脉结扎法，乙醚麻醉后将大鼠固定于手术台，颈部胸部备皮、消毒，铺无菌孔巾，在胸部左侧约0.5 cm处第4、5肋间切开皮肤，剪开心包，暴露心脏，以左冠状动脉主干为标志，在左心耳根部下方2 mm结扎左冠状动脉。标准肢体导联记录心电图。术后15 min心电图T波高尖、ST段显著抬高标志结扎成功。

　　1.2.5 实验动物分组 42只清洁级雄性Wistar大鼠（中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk20050001）。体重230～270 g，心梗造模成功后，随机分为假手术组，模型组，BMSCs组，EPCs+BMSCs组。其中假手术组，只开胸穿线，不结扎左冠状动脉；模型组开胸结扎左冠状动脉，注射细胞培养液。BMSCs组注射正常培养的BMSCs 500 μl，EPCs+BMSCs组SalB预处理EPCs后与BMSCs混合注射。

　　1.2.6 细胞移植 获取细胞混悬液，调整细胞浓度：BMSCs浓度为1×107/ml；SalB最佳药物浓度处理的EPCs浓度分别调整成1×105。治疗组手术结扎冠状动15 min后，再次打开胸腔，暴露心脏，用结核菌素注射器分别吸取250 μl BMSCs细胞悬液和250 μl SalB预处理的EPCs细胞悬液（BMSCs组只吸取500 μl BMSCs细胞悬液），分别于结扎区附近心肌组织分5点注射细胞，模型组注射同剂量细胞培养液。

　　1.2.7 BMSCs心肌Nkx2.5、GATA4基因表达的检测 4 w后，各组大鼠脱颈处死，迅速取心脏组织，置于液氮-70℃冰箱保存，检测组织mRNA的表达。RTPCR法。

　　1.3 统计学分析 数据以x±s表示，SPSS11.5统计软件，采用单因素方差进行组间比较。x

【摘要】 目的 探讨中药丹酚酸B预处理的内皮祖细胞（EPCs）对急性心肌梗死(AMI)大鼠移植骨髓间充质干细胞（BMSCs）向心肌分化早期基因表达的影响。方法 密度梯度离心法和贴壁筛选法培养、纯化EPCs与BMSCs；免疫细胞化学法（CD34/CD133/CD44）分别鉴定两种细胞。结扎大鼠左冠状动脉，制作大鼠AMI模型，42只大鼠随机分为假手术组，模型组，BMSCs组，EPCs+BMSCs组，其中治疗组用丹酚酸B最佳药物浓度处理的EPCs与BMSCs混合，在大鼠AMI区周边分五点注射。RTPCR检测心肌分化早期基因Nkx2.5、GATA4表达。结果 细胞移植4 w后，EPCs+BMSCs组心肌Nkx2.5、GATA4表达量分别为2.256±0.524和1.567±0.287，与对照组比较差异显著。结论 丹酚酸B预处理的EPCs联合BMSCs的移植上调了BMSCs向心肌分化过程中Nkx2.5、GATA4基因的表达，对心肌细胞的数量增加有重要影响，从而有可能改善心功能。

【关键词】 丹酚酸B；急性心肌梗死；内皮祖细胞；骨髓间充质干细胞；细胞移植

　　【Abstract】 Objective To investigate the effect of salvianolic acid B preconditioned endothelial progenitor cells combined with bone mesenchymal stem cells on gene expression in rats′ models of acute myocardial infarction(AMI). Methods Cultivation and purification of EPCs and BMSCs in vitro were by densitygradient centrifugation and plastic adherence method， and were identified by immunofluorescence and immunocytochemistry (CD34/CD133/CD44). The rat model of AMI was produced by ligation of the coronary artery. 42 rats were pided randomly by model， sham， BMSCs and EPCs combined with BMSCs groups， and EPCs preconditioned with salvianolic acid B combined with BMSCs were injected into the five points of heart ischemia area. After 4 weeks， the expression of Nkx2.5， GATA4 were examined by realtime PCR. Results The expression of NKx2.5 and GATA4mRNA were 1.700±0.382 and 1.135±0.257 respectively， which increased remarkably compared with control group. Conclusions The EPCs preconditioned with salvianolic acid B combined with BMSCs transplantation can increase the expression of NKx2.5 and GATA4， which improve the cardiac function.
　　
　　【Key words】 Salvianolic acid B (SalB); Endothelial progenitor cells (EPCs); Bone mesenchymal stem Cells (BMSCs); Acute myocardialin infarction (AMI)

　　移植的干细胞能在受损心肌部位分化成为新的心肌样细胞〔1，2〕，而骨髓间充质干细胞（BMSCs）因自体来源，取材容易，扩增能力强，成为研究热点。目前研究主要集中在通过药物诱导来提高间充质干细胞（MSCs）移植后的存活和定向分化〔3，4〕。本文前期的研究结果表明丹酚酸B(SalB)可以减小心肌梗死的面积〔5〕，促进心脏功能的恢复。内皮祖细胞(EPCs)是血管内皮的前体细胞，移植后促进缺血性疾病的血管再生和侧支循环建立已被证明〔6〕。因此本文采用SalB预处理EPCs，与BMSCs联合移植，观察急性心肌梗死（AMI）大鼠模型BMSCs向心肌细胞分化过程中早期基因Nkx2.5、GATA4的表达情况。

　　1 资料与方法

　　1.1 材料 LDMEM (美国Gibco公司)；特级胎牛血清（美国Hyclone公司）；血管内皮生长因子（VEGF），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），纤维连接蛋白(R＆D公司)；大鼠单个核细胞分离液（天津灏洋）；5％CO2恒温培养箱（model TC2323 CO2 incubator）；CD34兔多克隆抗体，CD44兔多克隆抗体(武汉博士德），CD133兔多克隆抗体（天津灏洋）；SalB（天津天士力现代中药资源有限公司，批号20060601）；ABI7300实时定量PCR仪；逆转录试剂盒、SYBR(R) Premix Ex TaqTM（宝生物工程（大连）有限公司）；Trizol总RNA提取试剂（天津润泰科技发展有限公司）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 EPCs培养与鉴定 贴壁培养和密度梯度离心结合法：雄性Wistar大鼠，脱颈处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，DHank液冲洗骨髓，筛网过滤，将大鼠单个核细胞分离液（密度为1.080 g/ml）预先置于试管的底部，按照1∶1的比例缓慢滴加骨髓悬液，离心（2 000 r/min，15 min），抽取位于界面层灰白色的单个核细胞，用DHank离心洗涤后，以2.0×105/cm2的密度接种于纤维连接蛋白(5 μg/cm2)的包被的培养瓶中，LDMEM（含体积分数为15%胎牛血清，15%VEGF，15% bFGF），置于37℃，5% CO2饱和湿度的培养箱中培养，4 d后首次换液，继续培养至第7天。选取生长良好的培养至7 d的EPCs，用SABC法检测细胞表面抗原CD34、CD133。CD34、CD133定位于细胞膜及细胞质。以细胞膜和细胞质出现棕黄色、高出背景色者为阳性细胞。

　　1.2.2 BMSCs培养与鉴定 贴壁培养和密度梯度离心结合法：雄性Wistar大鼠，脱颈处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，DHank液冲洗骨髓，筛网过滤，将percoll细胞分离液（密度1.073 g/ml）预先置于试管的底部，按照1∶1的比例缓慢滴加骨髓悬液，离心（1 800 r/min，20 min），收获位于界面层灰白色的单个核细胞，用DMEM离心洗涤后以3.0×105/cm2的密度接种于DMEM（含10%胎牛血清），置于37℃，5% CO2饱和湿度的培养箱中继续培养，48 h后首次换液，以后每3 d更换一次培养液。2 w后，细胞长满80%瓶底。BMSCs表达CD44，但不表达CD34。

　　1.2.3 MTT方法检测SalB的最佳药物浓度 设立SalB浓度为0，0.25，0.5，1，2，4，8，16，32，64 μg/ml共10组，MTT方法分别测定细胞的吸光度（OD）值，根据OD值均数确定SalB的最佳药物浓度。

　　1.2.4 大鼠AMI模型的制作 冠状动脉结扎法，乙醚麻醉后将大鼠固定于手术台，颈部胸部备皮、消毒，铺无菌孔巾，在胸部左侧约0.5 cm处第4、5肋间切开皮肤，剪开心包，暴露心脏，以左冠状动脉主干为标志，在左心耳根部下方2 mm结扎左冠状动脉。标准肢体导联记录心电图。术后15 min心电图T波高尖、ST段显著抬高标志结扎成功。

　　1.2.5 实验动物分组 42只清洁级雄性Wistar大鼠（中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk20050001）。体重230～270 g，心梗造模成功后，随机分为假手术组，模型组，BMSCs组，EPCs+BMSCs组。其中假手术组，只开胸穿线，不结扎左冠状动脉；模型组开胸结扎左冠状动脉，注射细胞培养液。BMSCs组注射正常培养的BMSCs 500 μl，EPCs+BMSCs组SalB预处理EPCs后与BMSCs混合注射。

　　1.2.6 细胞移植 获取细胞混悬液，调整细胞浓度：BMSCs浓度为1×107/ml；SalB最佳药物浓度处理的EPCs浓度分别调整成1×105。治疗组手术结扎冠状动15 min后，再次打开胸腔，暴露心脏，用结核菌素注射器分别吸取250 μl BMSCs细胞悬液和250 μl SalB预处理的EPCs细胞悬液（BMSCs组只吸取500 μl BMSCs细胞悬液），分别于结扎区附近心肌组织分5点注射细胞，模型组注射同剂量细胞培养液。

　　1.2.7 BMSCs心肌Nkx2.5、GATA4基因表达的检测 4 w后，各组大鼠脱颈处死，迅速取心脏组织，置于液氮-70℃冰箱保存，检测组织mRNA的表达。RTPCR法。

　　1.3 统计学分析 数据以x±s表示，SPSS11.5统计软件，采用单因素方差进行组间比较。