卡那霉素对离体培养大鼠耳蜗毛细胞损害的实验研究

　　　　　　 作者：李婷钰 王苹 杜波 杜宝东

【摘要】 目的 观察并建立卡那霉素大鼠耳蜗毛细胞损伤的离体实验模型。方法 应用耳蜗基底膜分离取材技术、耳蜗器官离体培养技术和毛细胞纤毛荧光染色技术定量观察了不同浓度及不同给药时间卡那霉素对新生大鼠耳蜗毛细胞的损害规律。结果 卡那霉素对耳蜗毛细胞的损害程度随着剂量增加而加重，耳蜗毛细胞损害首先发生在外毛细胞，其病变规律是从耳蜗的底回向顶回发展。结论 卡那霉素对离体培养耳蜗毛细胞损害的时间剂量曲线与在体损伤规律一致。

【关键词】 毛细胞；卡那霉素；器官培养

目前对于氨基糖甙类抗生素耳毒性研究较多的是庆大霉素，卡那霉素耳毒性研究的在体实验资料较多，离体实验极少。离体实验可以通过控制培养条件，在培养基中研究单一因素对内耳细胞的影响，具有一定的研究价值。为了探索离体培养条件下卡那霉素耳毒性的实验方法，并在培养基中建立卡那霉素损害耳蜗毛细胞的实验模型，本研究应用耳蜗显微解剖技术〔1〕、耳蜗器官培养技术〔2〕、毛细胞静纤毛荧光染色技术〔3，4〕，成功地在培养基中模拟了不同浓度卡那霉素所引起的各种不同病变程度的耳蜗毛细胞损害模型，为进一步探讨卡那霉素耳中毒机制和有效的保护措施奠定实验基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 48只出生3 d的健康大乳鼠，吉林大学动物实验室提供，体重10 g，雌雄不拘。动物质量合格证号:SCXK(吉)20070003。

　　1.2 主要试剂及仪器 组织培养基DMEM和胎牛血清为美国Invitrogen 公司产品，卡那霉素和若单明鬼笔环肽（RodaminePhalloidin）为美国Sigma 公司产品。CO2培养箱为日本三洋公司产品，DX60 荧光显微镜为日本Olympus公司产品。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 耳蜗基底膜分离取材、离体培养 取24只大乳鼠， 用75%酒精喷洒小鼠头颈部进行表面皮肤消毒。断头后剪开顶骨并清除脑组织以充分暴露颅底。取出听泡立即移入Hanks培养液中，在放大40倍的解剖显微镜下用游丝镊分离取出全耳蜗基底膜。将分离取出的耳蜗基底膜立即移入含60 μl DMEM培养基的小皿中铺平。每12条基底膜为一组，共分4组。分别为正常对照组、0.5、1.0、5.0 mmol/L组。置于CO2培养箱，37℃、5%CO2的条件下培养24 h。分别在对应3组的培养皿中换入含有0.5、1.0、5.0 mmol/L卡那霉素的DMEM培养液，继续培养24 h。终止实验时吸出培养液，加入4%多聚甲醛固定30 min，0.1 mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3次后滴入0.25%Triton X100溶液5 min，然后每皿加入1 ml PBS，200倍的若单明鬼笔环肽溶液在室温下避光染色30 min。最后将耳蜗移入载玻片上的甘油滴中，铺平，盖上盖玻片。采用德国莱卡图像处理系统在荧光显微镜下观察染色结果并摄像分析。在长度为0.2 mm的显微镜摄影取景范围内对耳蜗基底膜铺片从底回向顶回逐个视野进行毛细胞计数，数据分析处理并绘制耳蜗分析图。

　　1.3.2 不同浓度、不同给药时间卡那霉素耳聋性研究方法 取24只大乳鼠，按上述方法制备基底膜，每12条基底膜为一组，共分4组，置于CO2培养箱，37℃、5%CO2的条件下培养24 h。其中3组的培养皿中换入含有1.0 mmol/L卡那霉素的DMEM培养液，另一组设为正常对照组，继续培养，分别于2、24、48 h终止实验，固定、染色及拍照、计数方法同上。

　　2 结果

　　图1 不同浓度卡那霉素对离体培养的大鼠耳蜗毛细胞损害（略）

　　2.1 不同浓度卡那霉素对离体培养的大鼠耳蜗毛细胞的损伤作用 正常耳蜗毛细胞在离体培养48 h的全过程中始终保持良好的生长状态，耳蜗螺旋器三排外毛细胞轮廓清楚，排列整齐；“V”形听毛染色清晰，各回仅见个别毛细胞缺失；支持细胞及内毛细胞完全正常。经0.5 mmol/L卡那霉素培养24 h后，耳蜗底回的外毛细胞首先发生散在缺失，但耳蜗中回和顶回的毛细胞基本正常，毛细胞计数结果与形态表现相一致。经1.0 mmol/L卡那霉素培养24 h后，耳蜗底回的内外毛细胞缺失明显可见，耳蜗中回的外毛细胞也开始出现大约20%缺失，但顶回的毛细胞仅散在缺失。经5.0 mmol/L卡那霉素培养24 h后，耳蜗底回和中回的毛细胞大部分缺失，耳蜗顶回的毛细胞也发生大约15%缺失，见图1。耳蜗毛细胞计数结果见图2。以上结果显示在较低浓度卡那霉素培养的样品中，病变只是发生在外毛细胞，表现为排列紊乱、肿胀或缺失，内毛细胞却基本保持完整。但随着卡那霉素浓度的增加，外毛细胞的坏死逐渐加重并可见毛细胞坏死后遗留的空“神经杯”，同时内毛细胞出现缺失，在更高浓度的样品中仅可见支持细胞仍然存在，但是内外毛细胞几乎全部缺失。表明耳蜗毛细胞的损害随着卡那霉素浓度的增大而加重，损伤由底回开始向顶回逐渐减轻。

　　2.2 卡那霉素耳蜗损伤的时间曲线及剂量曲线 未经卡那霉素处理的正常耳蜗毛细胞在培养48 h后保持良好的形态，经1.0 mmol/L卡那霉素培养12 h后，耳蜗底回的外毛细胞首先发生缺失，程度较轻，但耳蜗中回和顶回的毛细胞基本正常；24 h后，底回的外毛细胞缺失明显，中回毛细胞也出现15％缺失，但顶回的毛细胞基本正常；48 h后，耳蜗底回及中回的内外毛细胞严重缺失，顶回的毛细胞也发生大约15%缺失，显示耳蜗毛细胞的损害随着卡那霉素给药时间的延长而加重，于48 h后开始出现明显损伤，并由底回向顶回逐渐减轻。见图3。

　　图2 卡那霉素耳蜗损伤的剂量曲线（略）

　　图3 卡那霉素（1.0 mmol/L）耳蜗损伤的时间曲线（略）

　　3 讨论
　　
　　许多实验已证实细胞行为在机体内与在培养基中具有基本相同的规律。对培养基中的组织和细胞进行研究，可以排除复杂的体内其他干扰因素而使实验条件单一化，因此离体组织培养技术为研究细胞在单一因素改变下的变化规律以及探讨其变化机制提供了有价值的实验手段。耳蜗组织在离体培养状态下由于排除了动物在体条件下全身健康状况、肾脏功能状态、激素水平等多方面因素的影响，可以对毛细胞进行单一因素的研究，因此建立卡那霉素大鼠耳蜗毛细胞损伤的离体培养实验模型，具有一定的研究价值。
　　
　　大量动物在体实验证实：以庆大霉素、卡那霉素及丁胺卡那霉素为代表的氨基糖甙类抗生素对耳蜗毛细胞的损害具有以下规律〔5～9〕：①以底回最早出现并且程度最重，由底回向顶回发展，向上逐渐减轻；②毛细胞的损害程度与剂量呈正相关；③外毛细胞对药物的损害比内毛细胞敏感。本研究结果与在体实验结论一致。另外，本研究发现，卡那霉素对离体毛细胞的损伤于48 h开始表现明显，这与庆大霉素不同，后者于24 h即出现明显损伤。侯秋来等〔10〕离体实验研究发现，经0.5 mmol/L庆大霉素培养24 h后，耳蜗底回的内外毛细胞基本全部消失，耳蜗中回的外毛细胞也开始发生大约30%坏死；经1.0 mmol/L庆大霉素培养24 h后，耳蜗底回和中回的毛细胞全部消失，耳蜗顶回的毛细胞也发生大约50%坏死。这说明卡那霉素可能具有延迟损伤效应。

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　　10 侯秋来，丁大连，蒋海燕，等.庆大霉素对小鼠耳蜗毛细胞损害的离体培养试验模型〔J〕.中华耳科学杂志，2005;3(3):1913.