Ⅱ组代谢型谷氨酸受体阻断剂对老年痴呆大鼠模型脑内nNOS及nNOS mRNA表达的影响

　　　　　　 作者：冯荣芳 刘凌云 石卫东 李娜 冯亚青

【摘要】 目的 阐明Ⅱ组代谢型谷氨酸受体（metabotropic glutamate receptor 2/3，mGluR2/3）对老年性痴呆（AD）发病过程中一氧化氮（NO）的影响。方法 应用免疫组化和原位杂交方法，观察脑室应用Ⅱ组mGluR2/3阻断剂α甲基(4四唑基苯)甘氨酸 (MTPG)对脑室β淀粉样肽（Aβ）注射所致的AD大鼠神经型一氧化氮合酶（nNOS）及其mRNA表达的影响。48只SD大鼠随机分为假手术组、痴呆组、痴呆组+MTPG组，每组16只。各组大鼠均在Morris水迷宫测试后常温饲养1 w后取材观察。结果 假手术组海马CA1区锥体细胞轮廓清楚，排列整齐，胞浆有较弱的nNOS表达。痴呆组nNOS表达较假手术组明显增加，同时锥体细胞数目变少，锥体神经元的轮廓、形态出现明显的损伤性改变；脑室注射mGluR2/3阻断剂MTPG，可部分阻断AD引起的nNOS表达增加，对神经元的形态也有恢复作用。原位杂交与免疫组化显示相似的变化趋势。结论 mGluR2/3参与AD发病过程，NO信号通路可能发挥重要作用。

【关键词】 脑室Aβ注射；神经型一氧化氮合酶； 代谢型谷氨酸受体；α甲基(4四唑基苯)甘氨酸;SD大鼠

代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors，mGluRs)是脑内广泛存在的、与G蛋白偶联的膜受体，参与脑内许多生理、病理过程。研究证实， mGluRs参与脑缺血耐受的发病机制〔1〕，并在老年性痴呆(AD)的发病中起一定作用。一氧化氮 (NO) 作为非经典神经介质参与许多与谷氨酸受体激活相关的生理、病理过程〔2〕，如海马的长时程突触传递增强和小脑的长时程突触传递抑制、神经递质释放的调节、动物的学习和记忆〔3〕以及缺血耐受过程等〔4〕。本实验采用免疫组织化学和原位杂交方法，观察脑室应用Ⅱ组mGluR阻断剂α甲基(4四唑基苯)甘氨酸(MTPG)对AD发病过程中NO的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠48只，体重250～280 g（由河北医科大学实验动物中心提供)，随机分为假手术组、痴呆组和痴呆+MTPG组，每组16只。①假手术组：进行所有手术操作，注射等量蒸馏水。②痴呆组：于大鼠左侧脑室缓慢注入凝聚态β淀粉样肽（Aβ2535） （浓度为4 g/L）5 μl；③痴呆+MTPG组：大鼠左侧脑室注入A β25～35后1 w，于右侧脑室注射MTPG 0.04 mg(MTPG溶于人工脑脊液)，其他两组均右侧脑室注入等量人工脑脊液。4 w后进行Morris水迷宫检测，各组大鼠均于Morris水迷宫测试后1 w处死，其中8只用于脑组织病理学检测和免疫组化染色，8只用于原位杂交。

　　1.2 痴呆大鼠模型的复制 Aβ老化的处理：将Aβ25～35(片段序列为：HGSNKGAIIGLMOH)溶于蒸馏水(蒸馏水有利于Aβ25～35聚合)，浓度为4 g/L，在37℃保温箱中孵育4 d，使其变为凝聚态Aβ。参照文献〔5〕的方法复制痴呆大鼠模型：大鼠在10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉下，固定于江湾1型C大鼠立体定位仪上，常规消毒，切皮，暴露前囟，依据大鼠脑立体定位图谱，于前囟后0.8 mm，中线左旁开1.5 mm，用牙科钻开颅，切开硬膜，用微量进样器自脑表面垂直进针4.0 mm (AP：-0.8 mm，ML：1.5 mm，DL：4.0 mm)，于左侧脑室缓慢注入凝聚态Aβ25～35 5 μl，留针5 min，缓慢撤针；对照组动物经历同样的手术程序，注射等量蒸馏水。关闭切口，待动物清醒后，送回养笼，自由饮水，饮食。MTPG右侧脑室注射：方法同上，在AD建模后1 w，于前囟后0.8 mm，中线右旁开1.5 mm)，用牙科钻开颅，切开硬膜，用微量进样器自脑表面垂直进针4.0 mm (AP:-0.8 mm，ML:1.5 mm，DL:4.0 mm)，注射MTPG(4 mg/ml，溶于人工脑脊液)，每次注射MTPG 10 μl，1 min内注完，留针5 min；其他两组动物经历同样的手术过程，分别注射等体积的人工脑脊液；注射4 w后进行Morris水迷宫测试。

　　1.3 Morris水迷宫测试 大鼠空间学习记忆能力测试采用中国医学科学院研制的大鼠Morris水迷宫装置。测试包括定向航行试验和空间探索试验。在水迷宫水槽壁上标明 4个入水点，将水槽等分为4个象限，逃避平台置于第三象限。水槽内充以洁净自来水，水面高出平台 2 cm，并加入适量奶粉使水浑浊，水温控制于（20±2）℃。实验前1 d将大鼠放入不含平台的水槽中2 min，使其适应迷宫环境及游泳。试验共7 d。前6 d进行定向航行试验将大鼠从入水点置入水槽中，记录60 s内大鼠从入水到爬上平台所需时间即潜伏期。每只大鼠每天训练4次，即从4个不同象限入水点入水进行训练各1次。训练中，若大鼠在60 s内找到平台，让其于平台上站立10 s；若未找到，用棒将其引上平台，并让其站立10 s，潜伏期记为60 s。第 7天进行空间探索试验：撤去平台，将大鼠从第二象限入水点放入水槽，记录60 s内其在平台象限(第三象限)的滞留时间。

　　1.4 脑组织病理学检测 在预定取材时间点，将动物戊巴比妥钠深麻醉后，开胸经升主动脉依次灌注4℃生理盐水100 ml，4℃40 g/L多聚甲醛250 ml（10 min快速阶段，50 min慢速阶段）后，取出大脑。冠状切取视交叉后1～4 mm脑组织，用40 g/L多聚甲醛固定2～4 h，常规脱水，石蜡包埋。在背侧海马水平连续切片，片厚6 μm，展片、脱蜡后，硫堇染色下观察海马CA1区迟发性神经元死亡(DND)情况。在光学显微镜下对海马CA1区组织学改变进行分级(Histological grade，HG)，标准如下：0级：无神经元死亡；1级：散在的神经元死亡；2级：成片的神经元死亡；3级：几乎全部神经元死亡。取双侧平均值作为统计值。高倍镜下计数双侧海马CA1区1 mm长度区段内存活的锥体细胞数，每侧计数3个区段，取其平均数为神经元密度(ND)〔6〕。

　　1.5 免疫组化染色及分析 取材、切片同脑组织病理学检测。切片首先在3%h3O2 孵育 10 min 以消除内源性过氧化物酶活性，微波照射15 min以充分暴露抗原，在用100 ml/L的正常山羊血清37℃孵育30 min后，加入一抗(1∶50 稀释，免抗nNOS，武汉博士德生物公司) 4℃孵育过夜，加入二抗（生物素标记的羊抗兔lgG复合物）、在37℃ 孵育30 min后，用0.01 mol/L PBS冲洗，辣根酶标记链酶卵白素37 ℃孵育30 min，用DAB(二氨基联苯)显影。用0.01 mol/L PBS代替nNOS抗体作为阴性对照。在光学显微镜下，观察大鼠海马CA1区nNOS阳性细胞的形态及分布特征。通过彩色图文分析系统(HPIAS1000彩色图文分析系统，同济医科大学)，计数视野内阳性细胞数目，测量阳性细胞截面总面积、平均光密度以反映免疫组化染色的程度。每个标本测量5个视野取其平均值。总面积、平均光密度数值越大，表示nNOS表达越强。

　　1.6 原位杂交 在预定取材时间点断头处死动物，快速低温剥出大脑，冠状切取视交叉后1～4 mm脑组织，用新鲜配制的加有0.1%DEPC的40 g/L多聚甲醛固定50 min以阻止核糖核酸酶活性，0.1 mol/L PBS 4℃ 过夜，换液一次；梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，片厚7 μm，在含有0.1%DEPC 水的蒸馏水中展片、脱蜡后，行原位杂交染色。阴性对照采用预杂交液代替杂交液。相对定量分析方法同免疫组化。

　　1.7 统计学处理 组织学分级采用多样本等级资料的秩和检验；其他所用实验数据采用x±s表示，使用SPSS10统计软件包，进行独立样本t检验、单因素方差分析和相关分析。

　　2 结果

　　2.1 海马CA1区HG及和ND变化 假手术组海马CA1区锥体细胞排列紧密有序，细胞核大而圆，染色浅，核仁明显，未见明显胞浆浓染，核固缩等神经元变性受损征象。而痴呆大鼠海马CA1锥体神经细胞排列疏松，数目减少，细胞形态异常，许多细胞出现体积缩小，核浓染，锥体神经元密度明显降低；而痴呆+MTPG组海马CA1区锥体神经元密度明显改善，见图1，表1。

　　2.2 nNOS表达 假手术组海马CA1区锥体细胞轮廓清楚，排列整齐，胞浆有较弱nNOS表达（图2）。痴呆组nNOS表达很强（图2）；但是nNOS的表达增加伴随有锥体神经元排列的紊乱和外形的不规则(图1)。而且，锥体神经元的粗大的突起也显示免疫阳性反应。在痴呆+MTPG组中，nNOS的表达与痴呆组相比较弱，但表达的图形类似于痴呆组(图2，表2)。用0.01 mol/L PBS代替nNOS抗体的一组切片无阳性染色。

　　2.3 NOS mRNA表达 海马CA1区nNOS mRNA的表达的观察方法同免疫组化。原位杂交除了核中同时有少量表达外，与免疫组化显示相似的变化趋势（图3）。 原位杂交阴性对照，用预杂交液代替杂交液，结果不显色，见表3。

　　表1 各组海马CAI区组织学分级和ND（n=8）（略）

　　与假手术组比较：1）P＜0.05；与痴呆组比较：2）P＜0.05，下表同

　　表2 各组海马CA1区nNOS 阳性反应细胞数目、总面积及光密度（略）

　　表3 各组海马CA1区nNOS mRNA免疫阳性细胞数目、总面积及光密度（略）

　　图1 各组大鼠海马CA1区锥体细胞的组织学分级(×100)（略）

　　图2 各组大鼠海马CA1区锥体细胞nNOS免疫阳性表达(×100)（略）

　　图3 原位杂交方法显示各组大鼠海马CA1区锥体细胞nNOS mRNA的阳性表达 (×100)（略）

　　3 讨论
　　
　　本研究发现，脑室注射MTPG这一强的选择性mGluR2/3阻断剂，能明显阻断AD所致的海马锥体神经元损伤，表明mGluR2/3 AD所致的神经元损伤中发挥重要作用。关于AD发病中mGluR2/3激活的机制，可能与细胞外谷氨酸的增加有关。离子型谷氨酸受体居于突触后膜的中心，而mGluRs可能居于突触后膜的外围， mGluR2/3不参与神经细胞之间正常的兴奋传导，可被过量的谷氨酸激活〔6，7〕。在AD脑中，有持续的谷氨酸向细胞外释放引起部分去极化产生的背景噪音，导致细胞外谷氨酸浓度增加；因此， AD中谷氨酸的释放，在某种程度上 增加了细胞外谷氨酸浓度，进一步激活mGluR2/3。
　　
　　本研究结果表明AD能引起nNOS和NO表达增加，而MTPG不仅能阻断AD诱导的nNOS表达增加，而且能部分阻断AD中海马神经元的损伤。为阐明mGluR2/3激活的下游机制，作者观察了nNOS和其mRNA 在AD中表达的变化和MTPG对这种表达的影响，试图确定NO信号通路在mGluR2/3参与AD发病过程中的作用。免疫组化染色显示海马CA1区nNOS表达在AD中上调； AD动物海马CA1区nNOS的上调与AD的神经原的损伤一致，提示NO参与AD发病过程。
　　
　　脑室应用MTPG既能部分阻断AD神经损伤作用，又能部分阻断AD诱导的nNOS的上调。结果强烈提示激活mGluR2/3能上调nNOS的表达，导致NO产生，后者参与激活mGluR2/3介导的AD的发病。进一步观察mGluR2/3激动剂对AD中nNOS的效果将会为上述结论提供更多证据。
　　
　　痴呆组mGluR兴奋可能通过NOS活性依赖和非NOS活性依赖两条途径促进NO生成的增加〔8〕。一方面，痴呆组mGluR兴奋，可通过偶联的G蛋白介导磷酸肌醇（PI）系统的作用促进NO生成。G蛋白激活磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，将膜上的磷脂酰肌醇二磷脂（PIP2）水解为三磷酸肌醇（IP3）和二脂酰甘油（DG），构成相互配合的 IP3/Ca2+和 DG/PKC两条第二信使通路。IP3能刺激Ca2从内质网中释放；胞内钙的动员，启动一系列钙激活波，增加NOS活性和NO产生〔9〕；DG在膜内激活蛋白激酶C（PKC），调节离子通道的蛋白磷酸化，激活NOS对Ca2+浓度的敏感性而增加NO的释放〔10，11〕；另一方面，mGluR2/3可增加NO产生通过非NOS活性依赖途径；mGluR2/3能增加L精氨酸对NOS的可用性；L精氨酸通过增加钙调蛋白活性或/和增强细胞内储钙池的钙动员，增加NO的产生〔12〕。痴呆+MTPG组MTPG阻断AD中的神经损伤。本研究提示mGluR2/3参与AD发病可能通过NO信号通路起作用或与NO信号通路有关。

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