雷公藤初提物中萜类化合物分离及鉴别

【摘要】 目的：寻求一种大量、快速、稳定地从雷公藤中分离纯化生物活性物质的方法。方法：探索一系列的溶剂体系，在TBE 300A高速逆流色谱仪上，从雷公藤粗提物中分离纯化二萜化合物，并用1H NMR和13C NMR对化合物进行鉴定。结果：从雷公藤粗提物中分离纯化出五种二萜类化合物，分别为雷公藤内酯酮、异雷酚新内酯、山海棠素、雷酚内酯和雷酚萜甲醚，纯度分别为98.2%、96.6%、98.1%、95.1%、96.5%。结论：采用高速逆流色谱的方法，能从雷公藤提取物中一步分离得到5种二萜类化合物，为雷公藤中二萜类化合物的进一步研究打下了基础。

【关键词】 雷公藤;二萜化合物;高速逆流色谱

　　[Abstract] Objective: To find an efficient and convenient way to separate bioactive compounds from Tripterygium wilfordii. Methods: A possible most suitable solvent system was investigated and a highcapacity countercurrent chromatography instrument was tried to separate the diterpenoids from Tripterygium wilfordii. Results: Five diterpenoids were separated from Tripterygium wilfordii and these diterpenoids were identified as triptonide， isoneotriptophenolide， hypolide， triptophenolide and triptonoterpene methyl ether. Conclusions: Highcapacity countercurrent chromatography is a simple， repeatable and convenient way to separate bioactive compounds from Tripterygium wilfordii.

　　[Key words] Tripterygium wilfordii; Diterpenoids; Highspeed countercurrent chromatography

　　雷公藤是一种著名中药，200多年来广泛用于治疗多种临床疾病[1，2]。近年来，人们发现雷公藤乙醇提取物中的二萜化合物在体内和体外实验中对多种肿瘤细胞表现出显著的抗肿瘤作用[3]，然而如何快速、有效地分离这些二萜化合物是目前尚未解决的问题。目前已有的从雷公藤中分离纯化生物活性物质的方法，如硅胶柱层析法、正相薄层色谱法等虽较为方便，但存在着耗时久、成本高、少量待分离样品易于吸附于固态支撑体的缺点。Y.Ito博士首创的高速逆流色谱技术(Highspeed countercurrent chromatography，HSCCC)是一种没有固态支撑体的液液分离色谱技术，具有速度快、耗溶剂量少、回收率高等独特优势，现已广泛应用于从中药中分离纯化生物活性物质[4]。

　　本研究在探索一系列溶剂体系的基础上，拟用TBE 300A高速逆流色谱仪从雷公藤粗提物中分离纯化二萜类化合物，并用1H NMR和13C NMR进行鉴定，以求寻得一种能大量、快速、稳定地从雷公藤中分离纯化生物活性物质的方法。

　　1 材料和方法

　　1.1 仪器与材料

　　1.1.1 实验仪器 TBE300A高速逆流色谱仪，配备KTA BASIC系统(Amersham Pharmacia Biotechnique Group，瑞典);Waters 2695高效液相色谱仪;Mercury Plus 400 NMR核磁共振光谱仪。

　　1.1.2 实验材料 高速逆流色谱分离用的分析级正己烷、乙酸乙酯、甲醇(成都市长钲化玻厂);高效液相色谱法用的色谱级甲醇(Fisher Chemical，Loughborough，UK);MilliQ纯水(18 MΩ，Millipore);雷公藤乙醇提取物粉末(桂林市三棱生物制品有限公司);硅胶(300～400目，青岛海洋化工厂)。

　　1.2 分配系数(K)的测量

　　按如下过程测定粗提物样品的分配系数值(K)：首先制备两相溶剂系统，将不同体积比的正己烷乙酸乙酯甲醇水(HEMW)，在分液漏斗中充分混匀，温度恒定为25 ℃，使用前将两相分离;待分相平衡后，分别将1 mL上相和1 mL下相转移到事先已加入1 mg粗提物粉末的试管，剧烈振荡5 min直至两相溶剂充分平衡。各相取500 μL分别移至另一试管，真空蒸干，用1 mL甲醇溶解，高效液相色谱测定分配系数K。K值定义为上相(固定相)和下相(流动相)中各目标化合物的峰面积之比。

　　1.3 样品溶液的制备

　　将200 g雷公藤乙醇提取物溶于400 mL二氯甲烷中，上3.1 kg硅胶柱(1 000 mm×98 mm ID，柱体积 6.3 L)。用不同体积比的二氯甲烷∶甲醇(100∶0，12 L;100∶1，16 L;50∶1，12 L;10∶1，12 L)洗涤，流速设置为140 mL/min。每500 mL收集馏分，并用薄层色谱分析，根据结果合并馏分，50 ℃真空蒸发，共得7种馏分，分别命名为A、B、C、D、E、F、G。

　　取馏分C粉末5 g，溶于250 mL上相中以备分离。

　　1.4 高速逆流色谱分离

　　使用TBE300A高速逆流色谱仪进行色谱分离：首先将上相泵入分离柱，直至分离柱被固定相灌满，转速为850 r/min，同时将下相以每分钟2 mL的流速泵入，当所有多余固定相溢出分离柱时，停止泵入流动相;然后将16 mL含有320 mg雷公藤粗提物的样品溶液通过进样阀注射到分离柱，温度设置为25 ℃，流出液用紫外检测仪UV900在254 nm波长下检测;最后收集馏分，每种馏分取1 mL在减压、50 ℃的条件下蒸干，将残留物溶解于甲醇，高效液相色谱法分析馏分。

　　1.5 高效液相色谱和核磁共振分析粗提物和馏分

　　高速逆流色谱分离出的粗提物和馏分用高效液相色谱和二极管阵列检测仪进行分析，流动相为甲醇和水：0→20 min，45%→95%，甲醇流速1 mL/min，温度40 ℃，检验波长为215 nm，粗提物与馏分分别溶解于甲醇中，以峰面积归一法计算各成分的含量，1H NMR和13C NMR鉴定馏分化学结构。

　　2 结果

　　2.1 不同溶剂系统中化合物的K值测定

　　结果见表1，当溶剂比例为3∶2∶3∶2时，K值最佳，可确定本实验使用这种比例的两相溶剂系统。表1 不同溶剂系统中化合物的K值

　　2.2 高效液相色谱法分析粗提物和高速逆流色谱馏分

　　高速逆流色谱法可以从雷公藤粗提物中一次性分离纯化得到6种馏分，分别为馏分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。每种馏分的纯度由高效液相色谱法测定，以面积归一法计算各馏分化合物的纯度，分别为98.2%、96.6%、98.1%、95.3%、95.1%、96.5%。峰IV和峰V很难由高效液相色谱法分离，但可被高速逆流色谱法成功分离。见图1。

　　2.3 化合物结构鉴定

　　根据1H NMR和13C NMR数据对各馏分进行鉴定，结果如下：

　　峰Ⅰ：ESITOFMS(m/z)：[M+1]+ 359.1495，分子式：C20h32O6。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：4.75(2H，m)，4.06(1H，d，J=2.8 Hz)，3.85(1H，d，J=3.2 Hz)，3.42(1H，d，J=3.2 Hz)，1.07(3H，s)，0.98，(3H，d，J=6.9 Hz)，0.89(3H，d，J=6.9 Hz)。13C NMR(400 MHz，CDCl3)δ：196.9，173.0，159.5，125.6，69.9，66.5，65.1，60.9，60.4，58.9，56.0，40.5，35.3，30.5，25.8，23.2，18.0，17.1，16.3，13.8。确定峰Ⅰ为雷公藤内酯酮。

　　峰Ⅱ：ESITOFMS(m/z)：[M+1]+ 343.1908，分子式：C21h36O4。1H NMR(400 MHz，CD3CN)δ：6.52(1H，s)，4.81 (2H，m)，3.60(3H，s)，3.18 (1H，sept，J=6.9 Hz)，1.13(6H，d，J = 6.9 Hz)，1.08 (3H，s)。13C NMR(400 MHz，CD3CN)δ：175.2，165.2，152.1，148.2，139.5，130.7，129.4，123.8，111.3，71.1，60.2，43.8，36.9，30.7，25.8，25.1，23.02，23.07，18.9，18.1，16.46。确定峰Ⅱ为异雷酚新内酯。

　　峰Ⅲ： ESITOFMS (m/z)：[M+1]+ 313.1806，分子式：C20h34O3。1H NMR(400 MHz，CD3CN)δ：7.01(1H，d，J=8 Hz)，6.92(1H，d，J=8 Hz)，4.82(2H，m)，3.19(1H，sept，J=7 Hz)，1.15(6H，d，J=7 Hz)，0.95(3H，s)。13C NMR(400 MHz，CD3CN)δ：175.1，164.9，151.2，144.1，132.1，123.7，122.9，121.9，116.1，71.0，40.7，35.9，32.3，26.1，22.7，22.19，22.10，21.6，19.0，17.7。确定峰Ⅲ为山海棠素。

　　峰Ⅴ：ESITOFMS (m/z)：[M+1]+327.1593，分子式：C20h32O4。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：13.0(1H，s)，7.42(1H，d，J=8 Hz)，6.88(1H，d，J=8 Hz)，4.77(2H，m)，3.35(1H，sept，J=6.9 Hz)，1.22(6H，d，J=6.9 Hz)，1.07(3H，s)。13C NMR(400 MHz，CDCl3)δ：202.2，173.3，161.7，159.7，149.1，136.0，133.7，126.1，114.7，113.6，69.9，40.3，36.48，36.41，31.6，26.2，22.2，22.1，21.7，17.8。确定峰Ⅴ为雷酚内酯。

　　峰Ⅵ：ESITOFMS(m/z)：[M+1]+331.2713，分子式：C21H30O3。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：6.50(1H，s)，3.58(3H，s)，3.23(1H，sept，J=6.9 Hz)，1.20(3H，s)，1.14，1.12，1.20(9H，3×CH3)，1.06(3H，s)。13C NMR(400 MHz，CDCl3)δ：219.8，150.7，148.4，139.3，131.3，131.0，111.7，60.7，51.9，47.2，38.0，35.4，34.4，28.4，26.4，26.0，23.8，23.7，20.4，20.0，19.9。确定峰Ⅵ为雷酚萜甲醚。

　　峰Ⅳ由于数量太少未能进行结构鉴定，需要进行进一步的鉴定。

　　通过高速逆流色谱的方法，我们从雷公藤粗提物中分离纯化出了五种二萜类化合物，分别为雷公藤内酯酮、异雷酚新内酯、山海棠素、雷酚内酯和雷酚萜甲醚，其分子结构见图2。

　　3 讨论

　　由于目标化合物的极性分布较广，因此，本实验选

　　图2 5种二萜化合物分子结构图

　　用极性范围较大的正己烷乙酸乙酯甲醇水(HEMW)溶剂系统从雷公藤中分离二萜类化合物，并测定不同配比溶剂系统的K值，来筛选一种最适合的溶剂系统。由表1可见，当正己烷乙酸乙酯甲醇水的比例为2∶1∶2∶1，K值太小，目标化合物在接近溶剂前沿的地方被洗脱出来;当溶剂比例为1∶1∶1∶1或6∶5∶6∶5时，K值太大，致使分离时间增加，峰较宽;当溶剂比例为3∶2∶3∶2时，K值最佳，所以本实验使用这种比例的两相溶剂系统。

　　对比粗提物色谱图和各馏分色谱图，可以发现峰IV和峰V这一对很难由高效液相色谱法分离的峰，成功地被高速逆流色谱法分离。本实验采用高速逆流色谱的方法，探索了一系列溶剂体系，成功地从雷公藤提取物中一步分离得到了5种二萜类化合物，为雷公藤中二萜类化合物的进一步研究奠定了基础。

参考文献

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　　[2] Ramgolam V， Ang SG， Lai YH， et al. Traditional chinese medicines as immunosuppressive agents [J]. Ann Acad Med， 2000， 29(1): 1116.

　　[3] Chang WT， Kang JJ， Lee KY， et al. Triptolide and chemotherapy cooperate in tumor cell apoptosis: a role for the p53 pathway [J]. J Biol Chem， 2001， 276(3): 22212227.

　　[4] Ito Y. Golden rules and pitfalls in selecting optimum conditions for highspeed countercurrent chromatography [J]. J Chromatogr A， 2005， 1065(2): 145168.