口面部穴位对内脏感觉的调控作用及其途径

　　　　作者：刘健华 符文彬 廖源 刘雪芳 陈杰斯 李心然

【摘要】 　　目的 探讨电针口面部穴位对内脏感觉的调控作用及其途径。 方法 成年SD大鼠30只，随机分为生理盐水组、内脏痛组、四白穴组、阳白穴组、颊车穴组，每组6只。生理盐水组腹腔注射0.9%生理盐水（1 ml/100 g)，不给予其他任何处理；内脏痛组腹腔注射乙酸造成内脏痛模型后不给予其他任何处理；四白穴组先电针双侧四白穴20 min，再腹腔注射乙酸造成内脏痛模型；阳白穴组和颊车穴组除电针穴位不同外，其余处理同四白穴组。处理完毕后，观察大鼠的行为学变化（扭体反应）以及孤束核（NTS）和三叉旁核（PTN）的cfos表达。结果 （1）大鼠腹腔注射0.6%的乙酸后，引发典型的内脏痛行为反应（扭体反应）。电针四白穴和颊车穴预处理后，由内脏痛引发的腹部收缩次数明显减少，与内脏痛组比较均有显著差异（P<0.01，P<0.05）；电针阳白穴对内脏痛大鼠腹部收缩的次数无明显影响。（2）电针四白穴预处理后，内脏痛所致NTS的cfos表达明显减少，与内脏痛组比较有显著差异（P<0.05）；电针颊车穴亦产生类似的作用；电针阳白穴作用不明显。（3）电针阳白穴预处理PTN的cfos阳性神经元数目与内脏痛组比较无明显变化。电针四白穴预处理后，三叉旁核的cfos表达较阳白穴组明显增加(P<0.01)；电针颊车穴亦出现与四白穴类似的效应。结论 （1）电针口面部穴位对大鼠内脏痛有显著的镇痛效应，且表现出一定的穴位特异性，与穴位的神经支配密切相关。（2）面口部穴位的躯体感觉传入可能经PTN中继后与胃肠道的内脏感觉传入在NTS发生汇聚并进行整合，PTNNTS组成的二级神经元传入通路可能是面口部穴位调节内脏功能活动的重要途径。

【关键词】 口面部穴位；内脏痛；孤束核；三叉旁核

　　【Abstract】 Objective To investigate the regulation of electroacupuncture (EA) at orofacial acupoints on visceral sensation and its pathway. Methods Thirty adult SpragueDawley rats were pided randomly into normal saline， visceral pain， Sibai acupoints， Jiache acupoints and Yangbai acupoints groups， 6 rats in each group. Visceral pain was induced by intraperitoneal injection of 0.6% acetic acid and was assessed by counting abdominal contraction. Meanwhile， cfos expression in the nucleus of the solitary tract (NTS) and paratrigeminal nucleus (PTN) was observed by immunohistochemistry. Results I.p. injection of acetic acid produced characteristic writhing movement， which was composed of the contraction of the flank muscles together with inward movements of the hindlimb. Pretreatment of EA at Sibai or Jiache acupoints induced cfos expression in the PTN and reduced abdominal contractions and cfos expression in the NTS elicited by acetic acid. However， pretreatment of EA at Yangbai acupoints did not. Conclusions (1)EA at orofacial acupoints have significant analgesia on visceral pain rats， and there is acupoints specificity in the effect， which is associated with nerve innervation of acupoints. (2) NTS may be an important supraspinal structure in the somatovisceral processing and there exists orofacial areasPTNNTS secondary neural pathway， which may be involved in the analgesia of EA at orofacial acupoints on visceral pain.

　　【Key words】 Orofacial acupoints; Visceral pain; Nucleus of the solitary tract; Paratrigeminal nucleus

　　经穴脏腑相关是中医经络学说的重要内容，其理论核心在于揭示人体体表与体表之间上下联系以及体表与内脏之间内外联系的特定规律。多年来，我国学者对此进行了大量研究，运用同神经节段支配理论对此进行了广泛探索，取得了一定的研究成果。但对于受不同神经节段支配的远隔部位间的特定联系尚缺乏系统、深入的研究。已有研究表明，面口部穴位对内脏的功能活动具有显著的调节作用〔1，2〕，并证实孤束核（nucleus of the solitary tract，NTS）在此过程中可能发挥重要作用〔3〕。本研究旨在探讨口面部穴位对内脏感觉的调控作用及机制，为经穴脏腑相关理论提供更加详实的科学依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组

　　选用体重180～220 g的成年SD大鼠30只，雌雄不限，由广州中医药大学实验动物中心提供。随机分为生理盐水组、内脏痛组、四白穴组、阳白穴组、颊车穴组，每组6只。生理盐水组腹腔注射0.9%生理盐水（1 ml/100 g)，不给予其他任何处理。内脏痛组腹腔注射乙酸造成内脏痛模型后不给予其他任何处理；四白穴组先电针双侧四白穴20 min（疏密波，2～20 Hz，强度以肉眼可见大鼠局部组织颤动为度），再腹腔注射乙酸造成内脏痛模型；阳白穴组和颊车穴组除电针穴位不同外，其余处理同四白穴组。

　　1.2 试剂与仪器

　　cfos免疫组化试剂盒（美国Santa Cruz），SABC免疫组化试剂盒（北京中山生物有限公司），DAB显色试剂盒（北京中山生物有限公司）；CM1850恒冷箱切片机（德国Leica)，G6805Ⅱ型电针治疗仪（上海医用电子仪器厂）。

　　1.3 穴位定位
　
　　采用比较解剖学进行大鼠穴位定位。四白穴位于眶下缘，眶下孔凹陷处；阳白穴位于眶上缘，瞳孔直上2.5 cm；颊车穴位于下颌角前上方0.5 cm。

　　1.4 造模方法

　　大鼠清醒状态下腹腔注射0.6%乙酸(10 ml/kg)造成大鼠内脏痛模型，引起典型的腹部肌肉收缩，同时伴有一侧后肢外伸〔4〕。

　　1.5 观察指标

　　1.5.1 扭体反应

　　腹腔注射生理盐水或乙酸后观察并记录60 min内大鼠腹部收缩的次数。

　　1.5.2 cfos表达

　　各组动物经处理后存活2 h，开胸经升主动脉插管进行灌流。先用0.9%生理盐水100 ml快速冲洗血液，然后用含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS（pH7.4)400 ml灌注固定50～60 min。灌注完毕后立即取延髓，置于上述灌流液中后固定4～6 h，再移入20%蔗糖PBS中过夜（4℃）至组织块沉底。次日取出组织做连续冠状切片，片厚40 μm，切片隔2张取1张，分数套收集于0.01 mol/L PBS(pH7.4) 中，进行免疫组织化学反应。①切片首先入0.03%的h3O2溶液中，室温30 min；②入0.3%TritonX100，室温30 min；③封闭用10％正常羊血清，室温20 min；④多克隆兔抗cfos血清（1∶100），置于湿盒中（4℃）冰箱中过夜；⑤用生物素标记的羊抗兔IgG（工作液），室温1 h；⑥辣根酶标记链霉卵白素复合物SA/HRP（工作液），室温1 h；⑦DAB呈色，室温3～5 min。上述各步骤之间（除了第3步以外）均用0.01 mol/L(pH7.4) PBS洗涤3次，每次5 min。切片裱于涂有明胶的载玻片上，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。室温晾干后，光镜下观察、计数。空白对照用PBS替代兔抗cfos血清进行上述免疫组织化学反应。替代对照用兔血清稀释液替代兔抗cfos血清进行上述免疫组织化学反应。

　　1.6 统计学方法

　　每只大鼠随机选取 6张切片，光镜下计算每张切片孤束核和三叉旁核cfos阳性神经元的数目。实验数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，全部数据输入计算机用SPSS10.0软件进行处理。

　　2 结 果

　　2.1 扭体反应

　　内脏痛组大鼠腹腔注射0.6%的乙酸后，引发典型的内脏痛行为反应（扭体反应），腹部肌肉收缩次数为（88.0±16.66），同时伴有一侧后肢外伸。腹腔注射生理盐水，大鼠不出现扭体反应。电针四白穴预处理后，由内脏痛引发的腹部收缩次数（43.2±11.19）明显减少，与内脏痛组比较有显著差异(P<0.01)；电针颊车穴后，大鼠腹部收缩的次数（36.2±13.50）较内脏痛组明显减少(P<0.05)；电针阳白穴后，内脏痛大鼠腹部收缩的次数（82.5±16.24）较内脏痛组无明显变化(P＞0.05)。

　　2.2 NTS cfos表达

　　腹腔注射生理盐水，NTS可见零星、散在的cfos阳性神经元（4.0±0.89）。腹腔注射乙酸，NTS的cfos表达(60.4±5.47）较生理盐水组明显增加(P<0.001)，其阳性神经元主要分布在NTS的内侧亚核、中间内侧亚核以及连合亚核。电针四白穴预处理后，内脏痛所致NTS cfos表达(45.2±5.85）明显减少，与内脏痛组比较有显著差异(P<0.05)；电针颊车穴亦产生类似的作用〔（33.8±7.72） vs （60.4±5.47），P<0.05〕；电针阳白穴，NTS cfos表达（67.6±3.99）与内脏痛组比较无明显变化(P>0.05)。见图1。

　　2.3 三叉旁核（paratrigeminal nucleus，PTN）的cfos表达

　　腹腔注射生理盐水，PTN无明显的cfos表达；腹腔注射乙酸后，PTN的cfos阳性神经元数目（6±1.32）较生理盐水组增加(P<0.01)；电针阳白穴预处理PTN的cfos阳性神经元数目(5.7±1.31）与内脏痛组比较无明显变化(P>0.05)；电针四白穴预处理后，PTN的cfos阳性神经元数目(22.3±4.72） 较阳白穴组明显增加(P<0.01)；电针颊车穴亦出现与四白穴类似的效应〔（19.7±3.50） vs （5.7±1.31），P<0.01〕。见图2。

　　3 讨 论
　　
　　本研究表明，电针口面部四白穴和颊车穴对内脏痛大鼠具有良好的镇痛效应，而电针阳白穴效果不明显，提示口面部穴位在镇痛效应中表现出一定的穴位特异性。在表现出镇痛作用的同时，电针四白穴和颊车穴明显减少NTS的cfos表达，而电针阳白穴的作用不明显，提示NTS在口面部穴位对内脏痛的镇痛效应中可能发挥重要作用。

　　NTS接受Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ对脑神经的一般和特殊的内脏传入纤维，是除盆腔脏器外的内脏初级感觉传入的低级中枢，被视为内脏感觉传入的重要中继站。来自内脏的机械、化学等多种伤害性刺激主要通过迷走神经直接上传至NTS〔5，6〕。此外，NTS神经元还可对躯体刺激反生反应〔7，8〕。NTS中广泛分布着促甲状腺激素释放激素、5羟色胺、γ氨基丁酸、N甲基D门冬氨酸等大量的神经递质、调质及其受体，参与内脏功能的调节作用〔9～13〕。同时，笔者的前期工作也表明胃扩张和电针口面部穴位均诱导NTS内侧亚核的cfos表达〔14〕，细胞外记录的结果进一步证实NTS存在对口面部的躯体刺激和胃扩张的内脏刺激同时起反应的神经元〔15〕。因此，NTS可能是胃肠道的内脏感觉传入和面口部穴位的躯体感觉传入汇聚及整合的重要中枢，参与电针四白穴对内脏痛的镇痛效应。

　　四白穴位于眶下孔，受三叉神经上颌支的分支眶下神经支配。颊车穴位于下颌部关节附近，受三叉神经下颌支的咬肌神经的支配。解剖学的研究表明，无论是眶下神经还是咬肌神经与NTS均无直接的纤维联系。因此，四白、颊车穴的躯体传入应该通过间接途径与NTS发生特定的联系从而发挥对内脏功能的调节作用。在本研究中还观察到电针四白穴和颊车穴后cfos在PTN的表达与NTS正好相反，表现为明显增加，提示针刺的信息可能通过PTN进行中继。PTN是位于三叉神经脊束核尾侧亚核（Vc）和极间亚核（Vi）之间一些散在的细胞群。PTN主要通过包括眶下神经、耳颞神经、咬肌神经在内的三叉神经接受头面部的躯体传入〔16～18〕，神经解剖和电生理的研究表明，PTN和NTS神经元均可被口面部皮肤、牙髓、颞下颌关节、咬肌的各种伤害性的化学、热、机械刺激所激活 〔19～22〕 。PTN与NTS之间有广泛的传出纤维联系，PTN投射至NTS的纤维终末与直接与接受胃肠等内脏感觉初级传入的终末区在NTS内相互重叠〔23〕。神经束路示踪技术表明，PTN存在着中继三叉神经初级传入并将之向NTS投射的神经元，提示三叉神经和NTS之间存在由二级神经元组成的传入通路〔24〕。此外，有研究证实PTN内存在大量向NTS投射的CB神经元，这些神经元可能参与消化、呼吸等内脏对外界刺激（如疼痛）的自主反应调节〔25，26〕。

　　综上所述，并结合笔者已有的研究工作，推测面口部穴位的躯体感觉传入可能经PTN中继后与胃肠道的内脏感觉传入在NTS发生汇聚并进行整合，PTNNTS组成的二级神经元传入通路可能是面口部穴位调节内脏功能活动的重要途径。

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