银杏叶提取物对实验性2型糖尿病大鼠脑组织的保护作用

　　　　　　 作者：杨旭芳 赵永光 杨云芳　　

【摘要】 　　目的 观察银杏叶提取物对实验性2 型糖尿病大鼠脑损伤的保护作用。方法 采用小剂量链脲佐菌素加高脂高热量饲料喂养的方法建立Wistar 大鼠2型糖尿病模型，成模后治疗组按8 mg/kg/d剂量腹腔注射银杏叶提取物，对照组及糖尿病组腹腔注射等容积生理盐水，每日1次，连续8 w。检测血糖、血胰岛素、血内皮素（ET）、脑组织中ET含量及治疗前后脑组织内ET的表达。结果 治疗组能明显降低大鼠血糖、血胰岛素及血浆、脑组织中ET含量，RTPCR检测结果显示ET mRNA表达明显下调。结论 银杏叶提取物对实验性2 型糖尿病大鼠脑组织损伤具有一定保护作用，可能与其对胰岛的修复及清除自由基，抗脂质过氧化作用及保护微血管，增加脑组织血供有关。

【关键词】 银杏叶提取物；2型糖尿病；脑；保护作用

　　糖尿病微血管病变所致的糖尿病脑病(diabetic encephalopathy，DE)主要表现为认知障碍，即记忆力减退、分析解决问题的能力与学习能力均下降。关于DE的预防与治疗，还未找到可靠有效的药物，目前对心血管系统具有保护作用的传统中药银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract，EGb)对DE的预防及其对脑组织的保护作用少有报道，故本研究应用链脲佐菌素(STZ) 建立大鼠糖尿病(DM)模型，观察EGb对实验性DM大鼠血糖、血胰岛素、血浆内皮素（ET）及脑组织中ET含量变化及治疗前后脑组织内ET表达的影响，旨在探讨EGb对DM大鼠脑损伤的保护作用及其可能的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂与药品

　　EGb购自北京双鹤天然药物有限公司，血糖试剂盒购自南京建成生物研究所。胰岛素、ET放免分析试剂盒购自中国人民解放军总医院科技开发中心放免研究所。STZ 购自华美生物工程公司北京分公司。

　　1.2 动物及分组

　　选用Wistar大鼠40只，由本院动物室提供，雌雄各半，体重200～250 g，大鼠禁食16～18 h，自由饮水，随机取30 只经尾静脉注射STZ(30 mg/kg)，2 w后，做葡萄糖耐量实验（OGTT），筛选糖耐量异常者共22只喂以高热量饮食，随机分为DM组和EGb，每组11只。治疗组按8 mg/kg剂量腹腔注射EGb，1次/d；DM组大鼠每日腹腔注射同体积生理盐水；另10只大鼠以普通饲料喂养，作为正常对照组，亦每日腹腔注射同体积生理盐水。三组均连续注射8 w。

　　1.3 血液样本的采集

　　大鼠空腹在乙醚麻醉下，内眦静脉取血约6 ml，2 000 r/min 离心15 min，取分离血清贮存于-20℃冰箱中，用于测定血清葡萄糖、胰岛素、ET。

　　1.4 脑组织匀浆的制备

　　取部分脑组织，用预冷生理盐水反复荡洗3 次，滤纸吸干，称重后置于玻璃匀浆器中，用冷冻处理的生理盐水将此标本制成1 ∶10 的组织匀浆，4 000～6 000 r/min离心15 min，取上清液备用。

　　1.5 脑组织ET mRNA表达的检测

　　把预留的脑组织快从-70℃冰箱中取出，取合适大小的组织快，放入预先用液氮预冷的研钵中研磨组织，加入500 μl Trizol，使其充分裂解，分别从三组中抽提总RNA，RTPCR检测ET的表达。引物序列为ET：正义5′TTTTCCCTCCTCTTCTTCTGAT3′；反义5′ACTTCTTGTCTTTTTGGTGAGC3′；βactin：正义5′CATGTACGTTGCTATCCAGGC3′；反义5′CTCCTTAATGTCACGCACGAT3′。并利用图像分析软件（ID Image Analysis Software）分析PCR产物/βactin灰度比值。

　　1.6 统计学处理

　　应用SPSS10.0统计软件进行分析，数据用x±s表示，组间差异的显著性用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 EGb对DM大鼠血糖的影响

　　实验10 w时，DM组大鼠表现出糖耐量异常的变化（P<0.05），1 h血糖增高显著（P<0.01）达高峰，2 h血糖仍较高；正常对照组大鼠30 min血糖达到峰值，2 h血糖基本恢复正常。10 w时治疗组则表现出糖耐量异常有明显改善。见表1。表1 实验10 w时血清葡萄糖水平（略)

　　2.2 血清胰岛素水平的改变

　　实验结束测定三组大鼠胰岛素水平，DM组高于对照组〔(50.90±13.63) vs (34.11±5.82) μU/ml〕（P<0.01），经EGb治疗后，胰岛素水平〔(40.96±6.41) μU/ml〕显著下降（P<0.05），见表2。
2.3 血浆及脑组织ET含量的测定 DM组大鼠血浆及脑中ET含量高于对照组（P<0.01），经EGb治疗后，血浆及脑中ET含量则低于DM组（P<0.05）。见表2。表2 实验10 w时血浆与脑组织中ET含量比较(略)

　　2.4 脑组织ET mRNA的表达

　　RTPCR检测结果显示，三组均见ET mRNA表达，正常组ET/ βactin为0.426±0.002，DM组为2.402±0.001，治疗组为1.102±0.001，治疗组ET mRNA表达较DM组明显下调。见图1。

　　3 讨 论

　　EGb是目前国内外药物治疗缺血性心脑血管病中的常用药物，其有效成分主要为银杏黄酮苷类和萜烯内酯类生物活性物质，具有清除氧自由基、抑制NO 的产生等作用〔1〕，还能舒张血管平滑肌、降低外周血流阻力、增加局部血流量、改善心脑等器官血液循环〔2，3〕。

　　DE是由于DM糖代谢紊乱导致脑血管改变，损害中枢神经系统，使大脑在结构、神经生理及精神等方面发生病理改变，以获得性认知行为缺陷为特征的DM慢性并发症〔4，5〕，有关DM脑神经细胞损伤的机制尚未明确，但一般认为与高血糖引起的代谢紊乱、氧自由基的作用以及血管内皮功能异常，促进ET的释放，最终导致血管舒张功能受损有关〔6〕。ET主要由内皮细胞产生，是血管内皮损伤的标记物，也是迄今发现的最强大、持续时间最长的血管收缩肽。

　　EGb具有显著的降糖、降低血浆胰岛素水平、清除氧自由基作用，本实验前期结果已阐述了EGb降糖、胰岛素、抗氧化应激的可能机制与其对胰岛的修复及清除自由基、抗脂质过氧化作用有关〔7〕，本次结果显示实验性DM大鼠血浆及脑组织内ET的含量较对照组显著升高，这与戴自英等报道一致〔6〕。但经EGb治疗后，ET水平明显下降，且脑组织内ET mRNA水平表达下调，提示EGb降低ET的作用是通过抑制ET基因表达实现的，具体的信号转导途径目前还不清楚，这将是下一步的研究目标，将为充分利用EGb，开发一类用于预防和治疗DM以及DE的有效制剂提供依据。

参考文献

　　1 La Casa C，Villegas L，Alarcon de la Lastra C，et al.Evidence for protective and antioxidant properties of rutin，a natural flavone，against ethanol induced gastric lesions〔J〕.J Ethnopharmacol，2000；71(12):4553.

　　2 Kubota Y，Tanaka N，Umegaki K，et al.Ginkgo biloba extractinduced relaxation of rat aortais associated with increase in endothelial intracellular calcium level〔J〕.Life Sci，2001；69(20)：232736.

　　3 Nishida S，Satoh H.Comparative vasodilating actions among terpenoids and flavonoids contained in Ginkgo biloba extract〔J〕.Clin Chim Acta，2004；339(12):12933.

　　4 田国庆，梁晓春.糖尿病性脑病〔J〕.中国康复理论与实践，2003；9（10）:6356.

　　5 Biessels Gj，van der Heide LP，Kamnal A，et al.Ageing and diabetes:implications for brain function〔J〕.Eur J Pharmacol，2002；441（12）:114.

　　6 戴自英，陈灏珠.实用内科学〔M〕.第11版.北京:人民卫生出版社，2001：953.

　　7 邹 辉，杨旭芳，郭尚福.银杏叶提取物对实验性2型糖尿病大鼠心肌的保护作用〔J〕.牡丹江医学院学报，2007；28（6）：911.