辛伐他汀对高脂血症大鼠心肌细胞内质网应激相关凋亡的影响

　　　　作者：周平 李法琦 张彬 常晓东 甘华 陈力学

【摘要】 　　目的 探讨辛伐他汀对高脂血症大鼠内质网应激（ERS）相关心肌细胞凋亡的影响及其机制。方法 清洁级雄性Wistar大鼠24只，随机分为正常对照组（n=8，普通饲料饲养），高脂血症组（n=8，高脂饲料饲养），辛伐他汀组（n=8，高脂饲料+辛伐他汀10 mg·kg-1·d-1灌胃饲养）。12 w后，全自动化生化仪检测血清甘油三酯(TG)及胆固醇(TC)水平；HE染色观察心肌组织的病理学变化；TUNEL法检测心肌细胞凋亡；免疫组化法及RTPCR技术检测心肌细胞ERS信号通路分子——葡萄糖调节蛋白（GRP）78的表达。结果 与正常对照组相比，高脂血症组血清TG和TC水平、心肌细胞凋亡程度和GRP78表达水平均显著升高(P＜0.01或P＜0.05)，且心肌组织结构异常；与高脂血症组比较，辛伐他汀组血清TG和TC水平、心肌细胞凋亡和GRP78表达水平均显著降低但仍高于正常对照组(P＜0.05)且心肌组织结构异常得到明显改善。结论 高脂血症可以通过激活ERS途径诱导心肌细胞凋亡并导致心肌组织结构异常，辛伐他汀可能通过干预ERS途径抑制高脂血症诱导的心肌细胞凋亡并逆转其心肌组织的结构异常，从而发挥心脏保护作用。

【关键词】 大鼠； 高脂血症； 内质网应激； 心肌细胞凋亡； 辛伐他汀

　　Effect of simvastatin on cardiomyocyte apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress in rats with hyperlipidemia

　　ZHOU Ping，LI FaQi，ZHANG Bin，et al.

　　Department of Gerontology，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

　　【Abstract】 Objective To investigate the cardioprotection and its mechanism of simvastatin on cardiomyocyte apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress in rats with hyperlipidemia.Methods Twentyfour male wistar rats were randomly pided into three groups：normal control group (n=8，fed with normal diet)，high fat group (n=8，fed!with high fat diet ) and simvastatin group(n=8，fed with high fat diet and received simvastatin 10mg·kg-1·d-1 by gastric irrigation).After twelve weaks，the serum triglycerides (TG) and cholesterol (TC) levels were determined by completely automatic biochemistry meter.The pathological changes of myocardial tissue were detected by HE staining.The apoptotic cardiomyocytes of myocardial tissue were tested by TUNEL.The expression of endoplasmic reticulum stress (ERS) associated molecleglucose regulated protein (GRP) 78 in myocardial tissue was investigated by immunohistochemistry and RTPCR.Results Compared with normal control group，the serum TG and TC levels，and the numbers of apoptotic cardiomyocytes as well as the expression of GRP78 protein and GRP78 mRNA in myocardial tissue were significantly increased in high fat group (P＜0.01 or 0.05).Compared with the high fat group，the serum TG and TC levels，and the numbers of apoptotic cardiomyocytes as well as the expression of GRP78 protein and GRP78 mRNA in myocardial tissue were remarkably reduced in simvastatin group but still higher than those in normal control group (all P＜0.05).Conclusions The hyperlipidemia can induce myocardiocyte apoptosis through activating ERS signaling pathways.The simvastatin can inhibit the myocardocyet apoptosis induced by hyperlipidemia through amelioration of ERS.

　　【Key words】 Rat;Hyperlipidemia；Endoplasmic reticulum stress；Cardiomycyte apoptosis；Simvastatin

　　高脂血症可诱发、加重心肌缺血再灌注引起心肌细胞凋亡〔1〕，心肌细胞凋亡在心肌重构及心力衰竭的发生、发展中起重要作用。内质网应激(ERS）作为细胞凋亡的新机制，参与心肌肥厚合并心力衰竭的心肌细胞凋亡过程〔2〕，我们推测ERS也可能参与高脂血症导致的心肌细胞凋亡的过程。辛伐他汀不仅通过调脂和稳定动脉粥样硬化斑块在心脑血管病防治中发挥重要的作用，而且通过激活一氧化氮合酶和磷脂酰肌醇3激酶蛋白激酶B(PI3K/Akt)细胞的信号途径发挥调脂外心脏保护作用〔3～5〕，但辛伐他汀能否通过调节ERS抑制高脂血症诱导的心肌细胞凋亡还未见相关的报道。本研究建立高脂血症大鼠模型，观察心肌细胞凋亡和ERS信号通路分子——葡萄糖调节蛋白(GRP)78的表达并采用辛伐他汀进行干预，探讨辛伐他汀对高脂血症大鼠ERS相关心肌细胞凋亡的影响及其作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物

　　清洁级雄性Wistar大鼠24只，4周龄，体重200～250 g。高脂饲料配方为：2%胆固醇、10%猪油、0.5%胆盐、5%蛋黄、0.2%的丙硫氧嘧啶、82.3%基础饲料。动物及基础饲料均由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供。

　　1.2 药品与试剂

　　辛伐他汀（舒降之）购自杭州默沙东公司，兔抗大鼠GRP78抗体购自美国Santa Cruz 公司，SABC免疫组化试剂盒、TUNEL试剂盒购自武汉博士德，RTPCR试剂盒购自TaKaRa公司；其余为国产分析纯试剂。

　　1.3 方法

　　1.3.1 动物模型的建立与分组

　　普通饲料分笼饲养1 w适应实验室条件后，大鼠随机分成3组，每组8只：①正常对照组：普通饲料喂养；② 高脂血症组：高脂饲料喂养；③辛伐他汀组：在高脂饲料喂养基础上给予辛伐他汀10 mg·kg-1·d-1灌胃，持续12 w。

　　1.3.2 标本采集

　　12 w时，取各组大鼠的尾静脉血，使用全自动化生化仪检测血清中胆固醇（TC）及甘油三酯（TG）含量。确定造模成功后，断髓法处死动物，消毒大鼠胸部，开胸腔迅速取出心脏，沿室间隔分离左心室，沿左心室最宽处垂直于长轴留取的心肌组织一部分置于4%多聚甲醛固定，另取0.5 g心肌组织于EP管中置于液氮保存，待提取总RNA，剩余心肌组织置-80℃冰箱保存。

　　1.3.3 心肌组织的病理学检测

　　4%多聚甲醛固定标本，常规脱水、石蜡包埋、切片(4 μm)后，行HE染色，光学显微镜下观察心肌组织的病理学改变。

　　1.3.4 心肌细胞凋亡的检测

　　TUNEL法检测心肌组织的心肌细胞凋亡，操作步骤严格按照TUNEL试剂盒说明书进行操作。光镜下正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡心肌细胞核呈棕黄色。每一切片选取5个视野，在200倍高倍镜下，计算阳性细胞数，并计算凋亡指数（CAI）。CAI =(阳性细胞数目／计数细胞总数)×100％。

　　1.3.5 免疫组织化学法检测心肌组织中GRP78的表达

　　切片常规脱蜡至水，微波修复抗原，用1∶1 000稀释的兔抗大鼠GRP78抗体孵育，在4℃条件下过夜。PBS冲洗后滴加羊抗兔IgG辣根过氧化酶，作用30 min。DAB显色，复染后封片。细胞质着棕黄色者为阳性表达细胞，细胞质无棕色或与背景色一致者为阴性。

　　1.3.6 RTPCR法检测心肌组织GRP78基因的表达水平

　　应用上游引物5′AGTGGTGGCCACTAATGGAG3′、下游引物5′CATGGTAGAGCGGAACAGGT3′，扩增GRP78编码的基因，预计产物的长度为289 bp。扩增βactin的引物为：上游5′AGTGGTGGCACTAATGGAG3′，下游5′TCTTTTGTCAGGGGTCGTTC3′，预计扩增产物长度696 bp。PCR的反应条件为：94℃ 3 min，94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min，35个循环，72℃延伸10 min。

　　1.4 统计学处理

　　采用 SPSS10.0统计软件包，数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较应用q检验。

　　2 结 果

　　2.1 血脂水平的变化

　　与正常对照组比较，高脂血症组大鼠血清TC和TG水平均显著升高（P＜0.01）；与高脂血症组比较，辛伐他汀组大鼠血清TC和TG水平明显降低但仍高于正常对照组，其差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。表1 大鼠血清TC、TG水平(略)

　　2.2 心肌组织病理学的改变

　　光镜下可见正常对照组心肌细胞排列规则、心肌细胞边界清晰、细胞核完整；高脂血症组心肌细胞排列紊乱、边界不清、心肌纤维断裂、部分细胞核溶解消失；辛伐他汀组心肌纤维排列稍疏、细胞核溶解较少，心肌损伤程度介于正常对照组与高脂血症组之间。见图1。

　　2.3 心肌细胞凋亡检测

　　正常对照组偶见心肌细胞凋亡，心肌细胞CAI为（2.6±0.25）％，高脂血症组心肌细胞CAI为（38.37±0.65）％，高于正常对照组（P＜0.05），辛伐他汀组心肌细胞CAI为（14.57±0.27）％，低于高脂血症组（P＜0.05）但仍高于正常对照组（P＜0.05）。见图2。

　　2.4 心肌组织GRP78蛋白表达水平

　　免疫组化结果显示，正常对照组心肌GRP78有微量表达，平均光密度值为（0.052±0.013，n=8）；高脂血症组GRP78蛋白呈强阳性表达，胞浆内充满棕黄色颗粒，平均光密度值（0.232±0.030，n=8）明显高于正常对照组（P＜0.05）；辛伐他汀组GRP78蛋白呈弱阳性表达，平均光密度值（0.145±0.016，n=8）明显低于高脂血症组。见图3。
2.5 心肌组织GRP78基因的表达水平 正常对照组GRP78 mRNA表达较低，其平均灰度值为（0.192±0.004，n=8）。高脂血症组GRP78 mRNA的表达明显高于正常对照组，具有显著统计学差异（P＜0.05），其平均灰度值为（0.784±0.024，n=8）；与高脂血症组比较，辛伐他汀组GRP78 mRNA的表达明显减少（0.421±0.012，n=8）但仍高于正常对照组，均有显著统计学差异（P均＜0.05）。见图4。

　　3 讨 论

　　高脂血症是一种常见的血脂代谢紊乱，且是心脑血管疾病发病的独立危险因素之一，其发病率逐年上升。研究发现，高血脂可以激活内皮细胞、单核细胞等多种炎症细胞，导致脂质过氧化反应产生大量的自由基，从而引起心肌细胞的功能障碍甚至心肌细胞损伤〔6，7〕；高脂血症也可以通过降低内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达使一氧化氮合成减少，从而导致心肌细胞损伤〔8〕。临床研究也发现，血液中高脂肪酸含量能够降低心肌细胞的葡萄糖代谢及心肌对缺氧的耐受性〔9〕。本文在高脂血症大鼠模型中发现，高脂血症组大鼠血清TC和TG水平显著增高的同时，其心肌组织发生结构紊乱且心肌细胞凋亡显著增加，提示高脂血症具有直接的心肌细胞毒性，可以导致心肌细胞和心肌组织的结构损伤和功能障碍。

　　内质网是参与细胞内蛋白质合成后折叠与聚集、细胞应激反应及细胞内钙离子水平的细胞器。ERS是由某种原因导致的内质网生理功能发生紊乱的一种亚细胞器病理过程，可加强内质网对蓄积在网腔内的错误折叠或未折叠蛋白质的处理，有利于维持细胞的正常功能并使之存活，但长时间的ERS可引起细胞凋亡〔10〕。由ERS诱发的细胞凋亡有3种细胞信号途径：①CHOP/GADD153基因激活转录途径；②JNK激活途径；③内质网特有的半胱氨酸蛋白酶caspase12激活途径。GRP78、GRP94、ERP29等蛋白是内质网分子伴侣蛋白，是发生ERS反应的重要标志性分子〔11〕。研究发现，在腹主动脉缩窄术后，大鼠发生心肌细胞凋亡的同时伴有GRP78表达增多〔12〕；腹主动脉结扎（TAC模型）引起心肌重构过程中，GRP78、GRP94、CHOP/GADD153的表达均上调〔13〕；缺血再灌注损伤引起心肌细胞凋亡过程中，ERS的标志性分子也大量表达〔14〕。这些研究都证实ERS参与心肌细胞凋亡和心肌重构的发生与发展。本文研究表明，高脂血症大鼠模型心肌组织排列紊乱，GRP78在基因及蛋白水平表达均上调，心肌细胞凋亡率显著增加，提示高脂血症激活了ERS相关的细胞凋亡信号途径，诱导心肌细胞凋亡和心肌组织结构异常，与文献报道一致。

　　辛伐他汀属于羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMGCoA）还原酶抑制剂，它不仅能够调节血脂水平，还具有清除氧自由基、抑制细胞黏附分子表达和改善血管内皮功能等作用。新近研究还发现，在前脑缺血再灌注损伤模型中，辛伐他汀可以通过减弱ERS发挥神经细胞保护作用〔15〕。本文在高脂血症大鼠模型中发现，辛伐他汀不但可以显著降低高脂血症大鼠的血脂（包括TC和TG）水平，而且显著大鼠的心肌细胞凋亡并且下调心肌组织ERS标志性分子GRP78的表达，提示辛伐他汀可能通过干预ERS途径抑制高脂血症诱导的心肌细胞凋亡并改善其心肌组织结构从而发挥心脏保护作用。

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