川芎嗪抑制大鼠局灶性脑缺血损伤神经元凋亡的作用

　　　　作者：柳朝阳 孙鹏 苗志 张涛 王建杰

【摘要】 　　目的 研究川芎嗪抑制大鼠局灶性脑缺血损伤神经凋亡作用的机制。方法 采用线栓法制作大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型，通过TUNEL染色及免疫组化染色动态观察川芎嗪对脑缺血再灌注大鼠神经元凋亡及bcl2、p53蛋白表达的影响。结果 再灌注各时间点，与缺血再灌注组相比，川芎嗪治疗组凋亡细胞数明显减少(P<0.01)，而 bcl2 蛋白阳性细胞数明显增多(P<0.05)。结论 川芎嗪能抑制脑缺血再灌注损伤神经元凋亡，其机制可能与上调bcl2蛋白表达有关。

【关键词】 川芎嗪；局灶性脑缺血；凋亡；bcl2

　　川芎嗪为中药川芎的有效成分，化学结构为四甲基吡嗪( tetramethylpyrazine， TMP)，在体内吸收后，能有效透过血脑屏障，并广泛分布大脑皮层、脑干、纹状体、海马、小脑和中脑等部位。近十几年来，TMP扩张血管的机制已有许多研究〔1〕。本研究采用川芎嗪干预大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血（MCAO）模型，动态观察神经细胞的形态改变以及bcl2蛋白表达情况，探讨川芎嗪对局灶性脑缺血损伤神经保护的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品及试剂

　　川芎嗪注射液40 mg/2 ml(北京第四制药有限公司生产，批号20060701)，TUNEL染色试剂盒及bcl2蛋白免疫组化染色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.2 动物分组及模型制备

　　成年健康雄性Wistar大鼠36只，参照Longa等〔2〕的大脑中动脉线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞模型。缺血2 h后，将栓线向外轻轻拉出，恢复供血，形成再灌注。手术动物清醒后，出现左侧Horner征、右侧前肢肢体无力、肌张力降低则提示MCAO模型制作成功。模型制作成功后，按照随机原则， 首先分为缺血再灌注组（18只）和川芎嗪治疗组（18只），两组在脑缺血2 h后再灌注6、12、24 h共3个时间点各分为3个亚组，每组6只大鼠。治疗组大鼠在MCAO模型制备成功后分别腹腔注射川芎嗪40 mg/ kg；缺血组在相同时间点均腹腔注射等量生理盐水。

　　1.3 标本制备

　　再灌注后相应时间点对各组模型动物以2 ml 10%水合氯醛腹腔注射麻醉至深度昏迷，迅速开胸暴露心脏，以100 ml肝素生理盐水经主动脉弓快速灌注冲洗，随后以4%多聚甲醛PBS缓冲液(4℃，pH7.4)经主动脉弓灌注30 min。迅速取脑，冠状切开脑组织，取视交叉前后约0.5 mm处的组织，置于上述固定液中24 h。常规石蜡包埋，于视交叉处连续冠状切片，片厚5 μm，切片置于4℃保存备用。

　　1.4 TUNEL染色检测原位细胞凋亡

　　取已制备好的石蜡切片常规脱蜡、脱水、双氧水处理、蒸馏水洗涤后严格按照说明书逐步进行，使用DAB显色试剂盒，着棕黄色为阳性细胞。

　　1.5 免疫组化染色检测bcl2蛋白表达

　　严格按照试剂盒说明书逐步进行操作，胞质呈棕黄色或棕褐色为阳性细胞。

　　1.6 镜下观察

　　400倍光学显微镜下每张切片随机观察5个不重叠视野，计数阳性细胞数，取平均值。

　　1.7 统计学处理

　　所有实验数据均用x±s表示，采用SPSS 11.0统计软件进行方差分析和t检验。

　　2 结 果

　　2.1 TUNEL染色原位细胞凋亡检测结果

　　见表1和图1。随着再灌注时间的增加，缺血再灌注组凋亡细胞逐渐增多（P＜0.05）；再灌注各时间点，与缺血再灌注组相比，川芎嗪治疗组凋亡细胞数明显减少 (P<0.01)。表1 各组凋亡细胞表达（略)

　　2.2 免疫组化染色检测bcl2表达情况

　　见表2和图2。随着再灌注时间的增加，缺血再灌注组bcl2阳性细胞逐渐减少（P＜0.05）；再灌注各时间点，与缺血再灌注组相比，川芎嗪治疗组bcl2阳性细胞数明显增加(P<0.05)。表2 各组bcl2蛋白表达（略)

　　3 讨 论

　　缺血再灌注损伤的神经保护是目前国内外研究的热点。急性缺血性脑梗死的治疗主要是溶栓和神经保护相结合。溶栓在治疗疾病的同时，也不可避免地引起再灌注损伤。如何最大限度减少再灌注损伤，更好地保护已经受损的神经细胞成为急需解决的问题。寻找研发一种有效、平稳、安全的神经保护药物为解决这一问题提供了契机。以往的神经保护药物作用机制/靶点单一、副作用大、价格昂贵等原因，限制了其在临床的应用。祖国的传统医学具有整体观念的特点，中药又具有复方特征，可以作用于多靶点，而且中药来源广泛、价格低廉。鉴于此，越来越多的研究者把目光投向了传统中药。

　　细胞凋亡是缺血后神经细胞丢失的一种主要形式，但有关脑缺血后细胞凋亡的确切机制尚不清楚。研究表明，细胞凋亡过程受多种基因调控，其中原癌基因bcl2是调节细胞凋亡的最基本成员，被认为是能特异性抑制细胞凋亡发生的抗凋亡基因。bcl2蛋白为26 kD的细胞内膜蛋白，定位于内质网膜、线粒体膜和核膜。体内外实验均表明，bcl2蛋白能抑制多种因素诱发的细胞凋亡。腺病毒介导的bcl2高表达可阻止或延缓各种刺激诱导的神经元死亡〔3〕。肿瘤坏死因子(TNF)、环己酞亚胺(cycolhxeimide)都可通过诱导bcl2表达对抗缺氧NO诱发的神经元凋亡。由此可见，bcl2表达水平可能是调节神经元存活的主要因素。Martinou等用转基因技术使小鼠神经元内bcl2过度表达，梗死灶减少了50%，证实了bcl2具有神经元保护作用〔4〕。最近研究发现bcl2转染到梗死周围区域能够阻断核凋亡诱导因子的转位，从而提高皮层神经元的存活〔5〕。
　　
　　bcl2作为细胞凋亡调节网络中最重要的蛋白，影响或被影响着其他细胞凋亡相关基因和分子，如TGFβ、Hsp70、ICE、Myc及p53等。bcl2表达具有多种生理活性，可以阻止或降低射线、自由基、化学药物等引起的细胞凋亡，对氧化损伤造成的细胞凋亡具有肯定的抑制作用。其抗凋亡的机制迄今仍不是很清楚。但多数研究者认为：①bcl2发挥抗凋亡作用主要是直接对抗各种脂质的过氧化反应〔6〕；②抑制线粒体释放促凋亡蛋白质，如细胞色素c和凋亡诱导因子〔7〕，目前认为，bcl2减少缺血后神经元的丢失主要是通过阻断细胞色素C的释放和caspase3的活化来加以实现的〔8〕；③抑制Bax，bclxs等促凋亡基因作用的发挥；④抑制富含半胱氨酸蛋白酶的激活〔9〕；⑤bcl2过度表达可直接或间接引起线粒体膜的超极化，以维持细胞内钙离子的稳态。在凋亡过程中，凋亡蛋白酶发挥着与核酸内切酶同样重要的作用。而位于线粒体膜的bcl2蛋白可阻止细胞色素C和APaf的相互作用从而使凋亡蛋白酶激活受阻，因而可阻止细胞色素C介导的细胞凋亡〔10，11〕。本实验结果显示，脑缺血再灌注损伤可导致神经元凋亡，随着再灌注时间的增加凋亡细胞逐渐增多，再灌注各时间点，与缺血再灌注组相比，川芎嗪治疗组凋亡细胞数明显减少；脑缺血再灌注神经元中bcl2蛋白阳性细胞结构清晰、形态基本正常；再灌注各时间点，川芎嗪治疗组bcl2 蛋白阳性细胞数明显多于再灌注缺血对照组，提示川芎嗪能抑制脑缺血再灌注损伤导致的神经元凋亡。其机制可能是通过增加脑缺血再灌注损伤神经元bcl2蛋白表达，从而对脑缺血损伤发挥保护作用。

　　川芎嗪是一种临床治疗药物，与其他实验药物相比较，其临床试验相对安全易于开展， 研究前景较为乐观。但其对脑缺血再灌注损伤的其他保护机制及最佳治疗剂量、有效治疗时间窗等问题尚待进一步研究。

参考文献

　　1 杨光田，李树生，邓普珍.实验动物复苏及低氧时川芎嗪对心脑的作用〔J〕.中国急救医学，1997；17(1)：7.

　　2 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989；20(1)： 8491.

　　3 Tabira T.Singifieance of intraeellular a beta in Alzheimer′ｓ disease〔J〕. Nihon Shinkei Seishin Yakurigaku Zasshi，2002；22(5)：17580.

　　4 Hossmann KA.Viability thresholds and the penumbra of focal ischemia〔J〕.Annals Neurol，1994；36(4)：55765.

　　5 Mies G，Iijima T，Hossmann KA.Correlation between periinfarct DC shifts andischemic neuronal damage in rat〔J〕.Neuroreport，1993；4(6)：70911.

　　6 Makresbery WR， Lovell MA.Fourhydroxynonenal，a product of lipid peorxidation，is increased in the brain in Alzheimer′ｓ disease〔J〕.Neurobiol Aging，1998；19l：336.

　　7 Ahn YH，Koh JY，Hong SH.Protein　synthesisde pendent but bcl2independent cytochrome C releasec in zinc depletioninduced neuronal apoptosis〔J〕.J Neurosci Res，2000；61(5)：50814.

　　8 李 军，曾邦雄.脑缺血损伤级联反应的研究进展〔J〕.国外医学·麻醉学与复苏分册，2001；22（6）：3648.

　　9 王巧稚，刘广益，郭 勇.淀粉样前体蛋白与阿尔茨海默病神经细胞凋亡的关系〔J〕.四川解剖学杂志，2003；11(2)：324.

　　10 Nakatsuka H，Ohta S，Tanaka J，et al.Cytochrome　release　from mitochondria to　the cytosol was suppressed in the ischemiatoleranceinduced hippocampal CAI region after 5min forebrain ischemia in gerbils〔J〕. Neurosci Lett，2000；278(12)：536.

　　11 Antonwaieh FJ.Translocation of cytochrome ｃ following transient global ischemia in the gerbil〔J〕.J Neurosci Lett，1999；274(2)：1236.