Id3基因在心肌营养素1促心肌成纤维细胞增殖中的作用

　　　　 作者：周瑞红 李菊香 夏子荣 颜素娟 谭秋波

【摘要】 　　目的 探讨在高静水压条件下分化抑制因子3（inhibitory of differentiation 3，Id3 )基因在心肌营养素1 (cardiotrophin1，CT1 ) 促心肌成纤维细胞增殖中的作用。方法 3～4代心肌成纤维细胞用于实验，分为对照组( C 组)、CT1反义寡核苷酸组 (ASODN组) 、 正义寡核苷酸组 ( SODN组)、高静水压组( P 组)。利用自制压力培养装置，将各组细胞置于160 mmHg压力下培养8 h。CT1活性通过 Western印迹法分析测定，Id3基因表达通过RTPCR方法测定，MTT测定心肌成纤维细胞增殖 。结果 高静水压明显促进心肌成纤维细胞增殖 ，CT1表达上调，Id3 mRNA表达增加；CT1 ASODN干预后能抑制高静水压所致的细胞增殖，CT1表达下调，Id3 mRNA表达减少。结论 Id3 mRNA在心肌成纤维细胞中有明显表达，且与CT1促心肌成纤维细胞增殖密切相关。

【关键词】 心肌营养素1 ；心肌成纤维细胞 ；分化抑制因子3

　　近年有研究发现心肌营养素1 ( CT1 )与高血压心室重塑有一定的关联，在12周龄的自发性高血压大鼠(SHR)的肥厚心室肌中，CT1 mRNA明显升高〔1〕。另有研究发现，内源性或外源性的CT1能刺激成纤维细胞合成DNA及胶原，促进成纤维细胞生长〔2〕 。分化抑制因子（Id）3作为血清诱导的立即早期基因在小鼠成纤维细胞系中被首次发现，其基因由3个外显子和2个内含子组成〔3〕。Id3参与多种细胞生物学过程，包括骨骼肌的分化、血管平滑肌的增殖、胚胎的神经形成、骨和血管发生等〔4～7〕，表明CT1与Id3均存在于成纤维细胞中，且都有促进细胞增殖的作用，但他们之间是否存在某种联系，Id3在心肌成纤维细胞中的表达情况及 CT1促心肌成纤维细胞增殖的作用是否与Id3有关尚未见报道。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　出生1～3 d的SD乳鼠(南昌大学医学院医学实验动物科)；RTPCR试剂（Promega，USA）；Trizol( Invitrogen，USA)；DEPC，二甲基亚砜（DMSO)（Ameresco，USA）； DL2000 DNA Ladder Marker (上海生工) ；MTT增殖检测试剂盒(Sigma，USA) 。

　　1.2 方法

　　1.2.1 心肌成纤维细胞的原代培养及鉴定

　　在无菌条件下摘取4～5只大鼠心脏， 分离心室利用蛋白酶消化心肌组织， 差速贴壁法获得原代心肌成纤维细胞。第 3～4代细胞用于实验。鉴定方法参照文献〔9〕。

　　1.2.2 CT1反义链与正义链的设计与合成

　　以硫代磷酸修饰反义和正义寡核苷酸链，由上海生物工程有限公司合成，各自序列为：CT1反义寡核苷酸链(ASODN)：5′TGGCTCATGCTGGCCCCAGGCTGAT3； CT1正义寡核苷酸链(ASODN)：5′ATCAGCCTG′GGGCCAGCATGAGCCA3′。

　　1.2.3 实验分组及干预措施

　　①空白对照组(C) ：大气压下培养； ②高静水压组(P) ：160 mmHg 压力下培养8 h〔9〕；③CT1反义寡核苷酸组(ASODN组)：160 mmHg压力培养下，加入终浓度为10 μmol／L的ASODN；④CT1正义寡核苷酸组(SODN)：160 mmHg 压力培养下8 h，加入终浓度为10 μmol／L的SODN。

　　1.2.4 RTPCR法检测Id3 mRNA 的表达

　　按照Trizol试剂说明书提取心肌细胞总RNA。参照Promege公司提供的RTPC试剂盒说明书进行逆转录反应， PCR反应共35个循环。引物设计由 Gen Bank中获取目的基因全序列，借助primer primier 5.0软件设计完成，由上海生工合成，各引物序列（含参照序列①和目的序列②）见下 ：①βactin正义5′GTAAAGACCTCTATGCCAACA3′；反义5′ACTCATCGTACTCCTGCTTG3′，240 bp。②Id3正义5′CATCTCCCGATCCAGACA3′；反义5′TCATAATCAGGGCAACAGAG3′；494 bp。

　　1.2.5 蛋白表达的检测

　　Western 印迹法检测细胞裂解液中CT1蛋白表达情况，用 Lab Work 3.0 UVP软件分析条带的积分吸光度值， 相对蛋白含量用积分吸光度值表示。

　　1.2.6 心肌成纤维细胞增殖检测( MTT法)

　　在各种条件培养下的96孔板实验结束前4 h ，每孔加入5 g／L的MTT ( 四氮唑盐) 20 μl，实验结束后，弃去各孔中的培养基， 每孔加入DMSD 150 μl，振荡10 min，酶标仪测490 nm吸光度。

　　1.3 统计学处理

　　实验数据以x±s表示，应用 SPSS12.0软件。组间比较采用独立样本t检验，多组均数间比较采用单因素方差分析( ANOVA) ，两组均数间比较采用 LSD检验。

　　2 结 果

　　2.1 高静水压对心肌成纤维细胞Id3 mRNA表达的影响

　　在160 mmHg高静水压下，Id3 mRNA表达明显增加(P<0.05)；ASODN组Id3 mRNA的表达明显低于P组和C组(P<0.05)；SODN组与P组相比无显著差异(P>0.05)。见图1，表1。

　　2.2 高静水压对心肌成纤维细胞CT1蛋白表达的影响

　　在160 mmHg高静水压下，CT1蛋白表达明显增加(P<0.01)；ASODN组CT1蛋白表达明显低于P组(P<0.01)；SODN组与P组相比无显著差异(P>0.05)。见表1，图2。表1 各组Id3 mRNA、CT1蛋白表达灰度值及心肌成纤维细胞增殖（mTT法）比较(略)

　　2.3 MTT检测CT1的ASODN对高静水压刺激成纤维细胞的影响

　　成纤维细胞经160 mmHg的压力作用8 h后，明显增殖(P<0.05) ，CT1ASODN能抑制高静水压所致的细胞增殖(P<0.05)，而CT1 SODN组对高静水压的促细胞增殖作用无影响，表1。

　　3 讨 论

　　CT1主要存在于心脏组织中，是心脏正常生长、发育所必需的物质。心肌细胞和成纤维细胞都能表达CT1，且心肌中CTl mRNA 浓度和蛋白水平在 Dahl盐敏感大鼠的左室肥厚阶段和充血性心力衰竭阶段均明显增高。另有研究发现，内源性或外源性的CT1能刺激成纤维细胞合成DNA及胶原，促成纤维细胞生长。因此CT1在心室重塑（包括心肌成纤维细胞增值、心肌细胞肥大、胶原沉积等）中发挥重要作用，而其作用途径尚有待进一步研究。Id又称DNA结合抑制因子( inhibitor of differentiation／DNA binding)，包括Id1～Id4，属于螺旋环螺旋( HLH) 转录因子家族成员之一，主要通过与A类碱性HLH( bHLH) 蛋白(如E蛋白) 结合而发挥作用；因其本身缺乏DNA结合必需的碱性氨基酸序列，Id蛋白和E蛋白结合形成异二聚体后能够阻止E蛋白和其他bHLH蛋白结合，对bHLH转录因子活性起负调节作用〔8～10〕。Id3作为血清诱导的立即早期基因在小鼠成纤维细胞系中被首次发现，其表达受多条信号转导途径的调控，诱导Id3表达的因素有：血小板衍生生长因子、甲状腺刺激素、表皮生长因子、肝细胞生长因子、骨形态发生蛋白、转化生长因子、肿瘤坏死因子等，不同的刺激因素作用于不同的组织细胞，通过不同的信号途径，可导致Id3表达水平不同程度的升高或降低，其表达呈细胞特异性和双向调节性。因此Id3参与多种细胞生物学过程，包括骨骼肌的分化、血管平滑肌和肿瘤细胞的增殖、胚胎的神经形成、骨和血管发生等〔4～7〕。

　　笔者以往的研究发现心肌成纤维细胞在160 mmHg高静水压下培养8 h后，与对照组相比心肌成纤维细胞达到最大增殖效果〔11〕，本研究发现在此条件下CT1的表达亦明显增加，同时发现Id3 mRNA在心肌成纤维细胞中也有明显表达；当使用CT1ASODN干预后，心肌成纤维细胞增殖明显减弱，CT1的表达明显减少，Id3 mRNA在心肌成纤维细胞中的表达也明显下调，这表明CT1的作用与Id3 mRNA的表达有关；而使用CT1 SODN干预后，心肌成纤维细胞增殖、CT1和Id3 mRNA的表达均无明显变化，由此推断 Id3可能也在CT1促心肌成纤维细胞增殖或者促心肌重塑过程中发挥作用。

参考文献

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　　5 Ke BL.Id3 induces growth arrest and caspase2dependent apoptosis in B lymphocyte progenitor s〔J〕.J Immunol，2005；175(7) ：451827 .

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　　10 Christy BA，Sanders LK，Lau LF，et al.AnIdrelated helixloop helix protein encoded by a growth factorinducible gene〔J〕.Proc Nat Acad Sci USA，1991；88(5)：18159.

　　11 颜素娟，李菊香，陈 静，等.心肌营养素1在高血压心室重塑的作〔J〕.高血压杂志，2006；14(4)：2948.