Wistar大鼠骨髓间充质干细胞的培养、鉴定和标记

　　　　 作者：赵科研 柳克祥 侯明晓 孙江滨 吴慧颖 李博

【摘要】 　　目的 建立Wistar大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分离、培养的方法，并进行鉴定、标记。方法 采用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠的MSCs。采用相差显微镜观察MSCs的形态学特征；流式细胞仪检测第3代细胞表面标志抗原CD29、CD44、CD34和CD45的表达率；电镜检查第3代MSCs超微结构。DAPI标记MSCs为下一步进行体内细胞移植示踪。结果 原代培养的MSCs于6～8 h后贴壁，6 d左右形成集落，14 d 左右可达到80%～90%融合。第3代细胞表面标记物CD29，CD44，CD34和CD45的阳性率分别为98.6 %，78.2%，0.0%，0.3%。超微结构清晰，可见细胞器，如线粒体、粗面内质网和高尔基复合体，细胞核呈圆形或不规则，可见较多微绒毛。DAPI可良好标记MSCs细胞核，呈蓝色荧光。结论 采用全骨髓贴壁培养的方法能够成功分离和培养大鼠的MSCs，在第3代可获得高纯度MSCs。DAPI可以作为一种示踪剂标记MSCs。

【关键词】 细胞培养；间充质干细胞；种子细胞；示踪剂

　　【Abstract】 Objective To establish a method for isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs) from Wistar rats in vitro，and to identify characteristic of the cells and to label them after culture expansion.Methods MSCs were isolated and cultivated from the bone marrow of Wistar rats by adherent method.The morphology of MSCs was observed under phase contrast microscope.The expression of CD29 ， CD44 ， CD34 and CD45 of the third generation cells were analyzed by flow cytometry. Electron microscopic features were also observed and MSCs were labeled by DAPI. Results After 6 to 8 h primary culture ， MSCs adhered to plastic surface of the culture dish. 　About 6 d later ， the cells proliferated in colonies.Primary MSCs reached 80%～90%of confluence in 14 d approximately.The positive rates of CD29 ， CD44 ， CD34 ， and CD45 in MSCs at third generation were 98.6% ，78.2% ，0.0% ， and 0.3% respectively. Under the electron microscope MSCs had plentiful cytoplasm with mitochondria rough endoplasmic reticula and Golgi complexes.Their nuclei were round or irregular and there were plenty of microvilli on the surface. All of the MSCs after labeling by DAPI showed blue fluorescence by fluoroscope.Conclusions Mesenchymal stem cells can be successfully isolated and cultivated by adherent method.And higher purity MSCs can be picked up after culture expansion at P3. DAPI can be an effective tracer agent to label MSCs.

　　【Key words】 Cell culture;Mesenchymal stem cells;Seed cells; Tracer agent

　　骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的非造血干细胞，可以向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、干细胞、肌细胞、神经细胞以及心肌细胞分化〔1，2〕，具有高度可塑性，易于体外扩增，因其来源充足、取材方便，体外增殖能力相对较强，而且在异体移植中排斥反应小，被认为是组织工程和基因工程的理想种子细胞，为心血管疾病、神经疾病和骨关节疾病的治疗提供了一条全新的治疗方案。本文在总结贴壁分离法培养MSCs的基础上，优化MSCs纯化、鉴定、标记的方法，以获得稳定的培养体系，为应用组织工程技术提供大量的种子细胞。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物

　　清洁级雄性Wistar大鼠(3周鼠龄，60～70 g)，吉林大学动物实验中心提供。

　　1.2 主要试剂和药品

　　低糖DMEM培养基(Gibco公司)，特级胎牛血清(Gibco公司)，胰酶(Sigma公司)，亚美尼亚仓鼠抗大鼠CD29Alexa Fluor (Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD45过氧化物酶（FITC）(Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD44PE (Santa Cruz 公司)，小鼠抗大鼠CD34FITC(Santa Cruz公司)，46二脒基2苯基吲哚（DAPI）储存液(Sigma 公司)。

　　1.3 分离和培养

　　Wistar大鼠麻醉后处死，浸泡酒精15 min，无菌条件下分离股骨、胫骨，无血清DMEM冲洗骨髓腔，取混悬液，1 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀含10%胎牛血清的DMEM混悬，将获得的细胞接种在100 ml培养瓶中，5% CO2，37℃下培养24～48 h，换液，去除未贴壁细胞，2～3 d更换一次培养基，光镜观察细胞融合情况，细胞80%融合后传代，0.25%胰酶消化，用血球计数仪计数细胞、传代，培养3～5代细胞。

　　1.4 透射电镜样品制备

　　将培养3代10 cm2培养皿中约2×106个细胞以磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3 次，再以3 %戊二醛4℃固定1 h，送电镜室，脱水包埋并制作超薄切片，行透射电镜观察并拍照。

　　1.5 MSCs表面标记物检测

　　0.25%胰酶消化收获第3代细胞，收集1×106个细胞，洗涤1次，0～4℃预冷的70%乙醇1 ml边加入边摇匀，混匀后置于4℃冰箱待进行细胞表面标记物检测。检测时以1 ml PBS洗涤2次，加含10%山羊血清的 PBS常温孵育10 min，1 000 r/min离心5 min去上清，与饱和浓度的CD29Alexa Fluor、CD34FITC、CD44PE、CD45FITC单克隆抗体及其同型对照混匀，室温下闭光反应30 min，PBS 洗涤细胞，置于冰上，行流式细胞仪检测。

　　1.6 MSCs标记

　　将无菌的DAPI 储存液加入培养的MSCs爬片上清中，至终浓度为50 mg/L ，37 ℃孵育染色至少30 min。细胞至少用Hanks 平衡盐溶液冲洗6 遍以除去未结合的DAPI。荧光显微镜下观察细胞爬片。

　　2 结 果

　　2.1 MSCs相差显微镜观察细胞形态

　　骨髓细胞接种于培养瓶后，约6～8 h可见MSCs细胞贴壁，呈圆形或多角形，换液后，贴壁细胞清晰可见，2～3 d后可见少量短梭形、星形细胞分散贴壁生长，伸出伪足呈逗点状或短棒状；6 d左右可见放射状排列的细胞集落，伸出长短不一、粗细不均的突起、胞核大、核仁清晰。约14 d细胞融合80%～90%，呈漩涡状。传代细胞比原代细胞贴壁快，24 h内已全部贴壁、伸展，增殖迅速，均匀分布生长，3～4 d可见长梭形细胞80%～90%铺满培养皿形成单层。见图1。

　　2.3 MSCs的鉴定及标记

　　第3代细胞表面标记物CD29、CD44、CD34和CD45的阳性率分别为98.6 %、78.2%、0.0%、0.3%。见图3。细胞经DAPI标记后，细胞核呈蓝色。见图4。

　　3 讨 论

　　由于骨髓的细胞组成复杂，细胞功能各异，其中MSCs含量很低，约为骨髓低密度组分中有核细胞的0.001%～0.01%〔3〕，故分离高纯度的MSCs是原代培养关键性技术。目前，获得MSCs的方法主要有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法、免疫磁珠分选法〔4〕。而骨髓贴壁法操作步骤简单，既降低了离心对细胞的损害，又减少了污染机会，且分离的MSCs贴壁时间短，增殖快，细胞数量多，经传代后能够纯化，提示全骨髓贴壁法是一种更加简单有效的MSCs分离方法。

　　一般认为，间充质干细胞没有特异性表面抗原，整合素家族成员CD29、黏附分子CD44、CD166、CD105等是MSCs的重要标志物〔5〕，而MSCs不表达造血细胞表面抗原，如造血前体细胞标志抗原CD34、成熟造血细胞标志抗原CD38、白细胞标志抗原CD45、淋巴细胞表面抗原CD11a和单核细胞/巨噬细胞表面抗原CD14。因此，实验选取MSCs表达阳性的指标CD29、CD44，以及表达阴性的指标CD34和CD45作为鉴定参考指标〔2，6〕。本研究选择了CD29、CD34、CD44和CD45进行检测，结果表明培养的细胞CD29和CD44阳性，CD34和CD45阴性，符合MSCs的特点，经过传代，第三代可获得较高纯度的MSCs，可以作为稳定的种子细胞进行体内研究。

　　DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。DAPI对活细胞无毒性，不改变细胞器的超微结构，荧光保持时间较长。移植细胞的标记是研究其在体内的定位不可缺少的，目前常用的标记法有DAPI标记法、溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记法、染色体标记法、基因标记法。BrdU法存在只能标记增殖期细胞，且标记细胞不能直接观察等不足。染色体标记主要将雄性供体动物细胞移植到雌性动物体内，通过Y染色体杂交区别确认移植细胞。其优点在于可以终生标记，但也存在操作繁琐，无法观察活细胞等不足。基因标记法通过基因转染或直接从转基因动物取材，使被标记细胞携带绿色荧光蛋白（GFP）暼报告基因。但目前，实现报告基因在目的细胞中高效稳定表达仍然存在程序繁琐、实验周期长、成功率低等困难，而从转基因动物取材又因为动物来源困难，在国内较少开展〔7〕。本研究表明，DAPI起初标记率很高(接近100%)，1 w内可维持80%～90%标记率。但随着标记时间的延长，其标记效率迅速下降，3 w以后绝大多数细胞失去标记。

　　本实验完善贴壁法建立Wistar大鼠MSCs培养体系，经鉴定细胞纯度高，可以为体内移植提供大量的种子细胞。采用DAPI 进行细胞标记后，荧光显微镜下见所有MSCs 均已被标记蓝色荧光，提示DAPI 标记法敏感性好，标记效率高，可应用进行体内细胞移植的良好标记。

参考文献

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