BoxBehnken响应面设计法优化替硝唑环糊精包合物的制备工艺

　　　　　　 作者：邹国省，关浩彬，秦凌浩

【摘要】 目的 优化替硝唑β环糊精的制备工艺。方法 以包合物收率和药物包合率作为评价指标，采用BoxBehnken响应面设计法筛选处方配比及制备工艺，以DesignExpert软件进行数据拟合并与实际结果比较。结果 最佳制备条件:温度为37 ℃，环糊精TNZ摩尔比为2∶1，搅拌时间1.8 h;替硝唑β环糊精包合物收率与药物的包合率分别为52.42%和57.61%，与理论计算值偏差均小于10%。结论 经BoxBehnken响应面法优选的替硝唑β环糊精包合物，理化性质稳定，各项指标与理论值均能较好地吻合，模型选用合理有效。

【关键词】 BoxBehnken响应面法;替硝唑;β环糊精包合物

　　Abstract:Objective To optimize the preparation of tinidazoleβcyclodextrin complex.Methods Tinidazoleβcyclodextrin recovery ratio and drug entrapment efficiency were investigated as the index and optimized by BoxBehnken surface response design，which was carried out by the DesignExpert.Results The optimal processing parameters were: 37 ℃; βcyclodextrin∶ tinidazole=2∶1; mixing time=1.8 h. Based on this optimal parameters， tinidazoleβcyclodextrin recovery ratio and drug entrapment efficiency were 52.42% and 57.61%， respectively. The deviations of the measured values from the predicted ones were less than 10%.Conclusion Each index of the optimized tinidazoleβcyclodextrin complex was well fitted with the predicted value. The adopted model was reasonable and effective. The physicochemical properties of tinidazoleβcyclodextrin complex optimized by BoxBehnken were stable.

　　Key words:BoxBehnken design; tinidazole; βcyclodextrin complex

　　BoxBehnken试验设计法是响应面设计法的一种，它可以提供3到10个因素，高、中、低三水平的实验设计及分析。该方法使用方便，而且预测实验结果接近实际实验结果，因此被广泛地应用于药学试验研究中［1-5］。替硝唑（tinidazole ，TNZ）又名甲磺咪唑，是硝基咪唑类抗菌药物，对原虫(溶组织阿米巴、阴道滴虫等)和厌氧菌有良好活性，常用于呼吸道感染、妇科感染和口腔感染的治疗。替硝唑水中溶解度低，稳定性差，容易分解变黄。采用环糊精作为药物载体对其进行包合可以增加其稳定性。本文通过BoxBehnken试验设计对影响包合物制备的关键因素进行考察和优化，筛选出载药包合物的最佳制备工艺。

　　1 材料
　　
　　UV1700紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；B104LED生物显微镜 (重庆奥特光学仪器有限公司)；SZCLA恒温磁力搅拌器（巩义市中博仪器有限公司）；DZF6020真空干燥箱（杭州蓝天化验仪器厂）;替硝唑（浙江苏泊尔药业，批号：20080710）；β环糊精（上海奥特生物技术公司）；丙酮（天津大茂化学试剂厂）；其他试剂均为分析纯。

　　2 方法与结果

　　2.1 分析方法的建立
　　
　　精密称量TNZ 50 mg置100 mL量瓶中，加入0.1 mol/L HCl适量使之溶解，用蒸馏水稀释至刻度，在200～400 nm范围内对TNZ溶液、环糊精溶液进行紫外扫描，结果表明TNZ在317 nm处有最大紫外吸收，环糊精辅料对测定无干扰。
　　
　　将上述TNZ溶液适当稀释，配制成质量浓度为1、2、4、8、10、15、20 μg/mL溶液，以蒸馏水为空白在317 nm波长下测定其紫外吸收，以吸光度（A）对溶液质量浓度（C）进行线性回归，得回归方程：A=0.028C+0.0176，r=0.999 5。回收率为98.5%～102.1%， 平均日内精密度RSD为0.78%， 溶液在 6 h内测定稳定性良好。

　　2.2 包合物的制备
　　
　　精密称取环糊精适量，加入蒸馏水使之溶解。另精密称取TNZ，用5 mL丙酮常温或加热溶解，1 mL/min速度加入到已配好的环糊精溶液中，在恒温磁力搅拌下保持一定时间，置冰箱冷藏24 h后，抽滤，分别用5 mL稀HCl和5 mL丙酮洗涤沉淀物。将沉淀物置真空干燥箱中避光干燥2 h，精密称定其质量后，置干燥器中待用。

　　2.3 包合物制备工艺优化

　　2.3.1 单因素考察

　　分别考察反应温度、药物辅料摩尔比、搅拌时间、转速对包合物制备的影响并以包合物收率（RR）和包合物包合率（EE）作为指标（RR=包合物质量/［β环糊精质量+TNZ质量］×100%；EE=包合物中TNZ质量/包合物质量×100%）进行单因素考察，因素与水平安排见表1。表1 单因素试验水平表（略）
　　
　　按以上因素水平安排实验，结果：当固定其他实验条件，温度由30 ℃升高到50 ℃时，包合物的收率从27.5%增加至44.6%，但随着温度进一步升高超过50 ℃时，得到的包合物收率随温度变化不大；药物的包合率随着环糊精药物的摩尔比升高而增大，当环糊精药物摩尔比由1∶1提高到2∶1时，药物的包合率由13.74%提高至64.62%，转速由100 r/min提高至300 r/min，包合物的收率和药物包合率均无明显变化。以上结果表明：反应温度、药物与辅料的摩尔比和搅拌时间是影响包合物形成的主要因素。

　　2.3.2 BoxBehnken响应面法优化包合物制备工艺

　　根据单因素考察结果，选择温度、β环糊精替硝唑摩尔比、搅拌时间作为考察对象，以包合物收率和药物包合率作为评价指标对制备工艺进行优化，BoxBehnken试验因素设计及结果见表2。表2 BoxBehnken设计及结果（略）

　　根据包合物收率（RR）和药物包合率（EE）作为指标对影响因素进行多元线性和二次多项式数学模型拟合(多元线性拟合模型：Y=a1X1+a2X2+a3X3+d；二次多项式拟合模型：Y= a1X1+a2X2+a3X3+b1X1X2+b2X2X3+b3X1X3+c1X12+c2X22+c3X32+d)。
　　
　　多元线性拟合结果：
RR=43.58-0.94A+10.31B-2.13C(R2=0.5870)
EE=31.13+0.71A+23.28B+1.59C(R2=0.8337)
　　
　　二次多项式拟合结果：
RR=54.20-0.94A+10.31B-2.13C+2.40AB-2.58AC+0.98BC-11.97A2-7.62B2+2.35C2
(R2=0.9855)
EE=45.91+0.71A+23.28B+1.59C+2.84AB+8.86AC-0.78BC-14.09A2-2.72B2-7.50C2
(R2=0.9979)
　　
　　根据方程可知，对于包合物收率和药物的包合率，二次多项式的拟合度要好于多元线性模型。回归方程中各变量对指标(响应值)影响的显著性，由F检验来判定。由表3、表4可见，β环糊精与TNZ的摩尔比是影响包合物形成的主要因素，二者以1∶1的摩尔比例产生包合作用，随着β环糊精用量的增加，包合过程会继续向正反应进行，导致包合物收率和包合率的提高。回归方程也是高度显著的，相关系数R2=98.6%和99.8%说明响应值(包合物收率和药物包合率)来源于所选变量，即温度、β环糊精替硝唑摩尔比、搅拌时间。因此，回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该回归方程确定最佳提取工艺条件。表3 包合物收率（RR）回归分析（略）表4 包合率（EE）回归分析（略）

　　2.3.3 影响因素的响应面曲线图

　　根据DesignExpert 软件绘制不同影响因素对于响应值的三维曲线图见图1、图2。图1和图2为分别固定三个影响因素其中之一，而考察其他两个因素对包合物收率和药物包合率影响的响应曲面图。该图底部平面为等高线图，对于多参数的优化过程应在相应的影响因素等高线图重合区域进行考察。 根据BoxBehnken响应面试验设计结果，并结合包合物的制备工艺，得到优化条件为：温度 37 ℃，环糊精TNZ=2∶1(摩尔比)，搅拌时间 1.8 h。按照优化后工艺参数，制备3批样品分别测定其包合物的收率和药物的包合率，理论包合物收率为56.27%，药物包合率为55.75%；实际测得包合物收率为52.42%，药物包合率为57.61%；实测值与理论计算值偏差均小于10%。

　　2.4 包合物的鉴别
　　
　　将β环糊精溶液、TNZ包合物溶液、TNZ溶液在200～400 nm波长范围内扫描，结果表明：TNZ包合物溶液在317 nm处有强紫外吸收，与TNZ溶液吸收波长一致。分别取β环糊精、TNZ包合物、TNZ在显微镜下观察（见图3）。结果显示：TNZ与β环糊精具有不同的结晶形式，而TNZ包合物中未见药物的结晶，表明包合物已形成。

　　2.4 包合物的稳定性考察
　　
　　称量TNZ药物与相当药量的包合物分别置试管中，在自然光照条件下放置3 d，观察到TNZ药物颜色明显变黄，而包合物外观并无明显变化。分别称取TNZ及包合物20 mg于100 mL容量瓶中，加水溶解至刻度，置于80 ℃水浴中避光放置，分别于第0、1、2、3、4、5天测其含量变化，结果见图4。由图可见，载药包合物稳定性大大提高。

　　3 讨 论
　　
　　本试验通过BoxBehnken响应面法优化TNZβ环糊精包合物的制备工艺，实验结果表明，经过工艺参数优化后，理论预测的包合物收率和药物的包合率与实际测定值偏差在10%以内，证明其相关性良好。
　　
　　对载药包合物高温稳定性的考察结果表明，高温放置后，原药含量降低17.4%，而包合物含量未见明显降低，证明包合物可以显著提高药物的稳定性。包合物的鉴别可以采用多种方法，本文采用紫外法和显微观察初步鉴别包合物的形成，对于包合物的理化性质将在后续工作中进行进一步的研究。

参考文献

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