小儿清热利肺口服液中总绿原酸的含量测定方法研究

　　　　　　 作者：魏大华，冯敬文，王四元，龙晓英，陈金爱

【摘要】 目的 建立反相高效液相色谱法测定小儿清热利肺口服液中总绿原酸的含量。方法 采用DiamonsiLTM C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，乙腈体积分数0.4%H3PO4水溶液(体积比10∶90)为流动相，流速为1 mL·min-1，检测波长为327 nm，柱温为30 ℃。结果 绿原酸在质量浓度为16.28～81.4 μg范围内线性关系良好(r=0.999 6，n=5)，样品平均回收率为100.31%，RSD为1.45%。结论 本法简便、快速、准确，适用于小儿清热利肺口服液的质量控制。

【关键词】 小儿清热利肺口服液;高效液相色谱法;绿原酸;含量测定

　　Abstract:Objective To establish a RPHPLC method for the determination of total chlorogenic acids in Xiaoer Qingre Lifei ioral solution. Methods The assay was performed on DiamonsiLTM C18 column with the mobile phase of acetonirile0.4% phosphoric acid solution (10∶90) under a flow rate of 1 mL·min-1. The detection wavelength was set at 327 nm and column temperature was 30 ℃. Results It showed good linearity in the range of 16.28-81.4 μg of chlorogenic acid (r=0.999 6，n=5).The average recovery was 100.31% (RSD=1.45%). Conclusion The method is simple，rapid，accurate and can be used for the determination of total chlorogenic acids in Xiaoer Qingre Lifei oral solution.

　　Key words:Xiaoer Qingre Lifei oral solution; HPLC; chlorogenic acid; determination

　　小儿清热利肺口服液由银翘散和麻杏石甘汤2个古方合方化裁而成，处方由金银花、连翘、牛蒡子、麻黄、等11味中药组成[1]，主治外感风热邪在肺卫或卫气同病之风热咳嗽，用于发热、咳嗽，咯痰、流涕或鼻塞、咽痛、口渴、舌红黄等证候的小儿急性支气管炎。其中绿原酸为金银花的主要活性成分，在牛蒡子中含量亦较高。它是一种具有广泛生理和药理活性的物质，具有利胆、抗菌、降压、增加白细胞及兴奋中枢神经系统、抗肿瘤、降脂、清除自由基等多种药理作用[2]。小儿清热利肺口服液现有质量标准采用紫外分光光度法测定其盐酸麻黄碱含量，并未以绿原酸为含量测定指标。因此，本实验建立高效液相色谱法测定小儿清热利肺口服液中总绿原酸的含量，旨在为完善小儿清热利肺口服液的质量标准提供基础。

　　1 仪器与试药

　　LC20A高效液相色谱仪(日本岛津)，SPD紫外检测器，二元高压梯度泵;BP211D电子分析天平(Satorius);UV2450可见紫外分光光度仪(日本岛津); HH6恒温水浴锅(宏华新佳);绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110753200413);小儿清热利肺口服液(广州潘高寿药业股份有限公司提供，批号：E06002、F03002B、F10001B、I11002B);乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

　　广东药学院学报 第26卷 第4期 魏大华，等.小儿清热利肺口服液中总绿原酸的含量测定方法研究

　　 2 方法与结果

　　2.1 色谱条件

　　色谱柱：DiamonsiLTM C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱;流动相：乙腈体积分数0.4% H3PO4水溶液(体积比10∶90);流速：1 mL·min-1;检测波长：327 nm;柱温：30 ℃;进样量：20 μL。

　　2.2 对照品溶液的制备

　　精密称取绿原酸对照品(于室温用P2O5干燥24 h)8.14 mg，置20 mL棕色容量瓶中，加50%(体积分数)甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液。精密吸取绿原酸对照品贮备液2 mL置于25 mL容量瓶中，用50%(体积分数)甲醇稀释制成每1 mL含绿原酸 0.032 6 mg的对照品溶液。

　　2.3 供试品溶液的制备

　　精密吸取小儿清热利肺口服液1 mL至分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取4次，每次10 mL，合并正丁醇层于70 ℃水浴蒸干，残渣用50%(体积分数)甲醇溶解，定容至50 mL容量瓶中，摇匀，用0.45 μm微孔薄膜滤过，即得。

　　2.4 阴性对照溶液的制备

　　称取处方组成中除金银花和牛蒡子外的其余药材，按照生产工艺制备阴性样品，并按“2. 3”项下方法制备，即得阴性对照溶液。

　　2.5 系统适用性试验

　　分别紧密吸取对照品、供试品、阴性对照溶液各20 μL注入液相色谱仪中，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。在此条件下，阴性对绿原酸测定无干扰，绿原酸和其他组分可达到基线分离，分离度R>5。理论塔板数以绿原酸计，应不低于 1 000。结果见图1。

　　2.6 线性关系考察

　　精密吸取“2.2”项下绿原酸对照品贮备液各1、2、3、4、5 mL，分别至25 mL棕色容量瓶中，加50%(体积分数)甲醇稀释至刻度，摇匀，得绿原酸质量浓度分别为16.28、32.56、48.84、65.12、81.4 μg·mL-1的系列对照品溶液。分别精密吸取20 μL进样，按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积。以峰面积积分值(Y)为纵坐标，绿原酸对照品量(X，μg)为横坐标进行线性回归，求得回归方程为：

　　Y=6.2465×104X-3.6896×104，r=0.999 6。

　　结果表明，绿原酸在16.28～81.4 μg范围内，与峰面积呈良好线性关系。

　　2.7 精密度试验

　　精密吸取同一对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，重复进样5次，按“2.1”项下色谱条件测定绿原酸峰面积，结果RSD值为1.51%(n=5)，表明仪器精密度良好。

　　2.8 稳定性试验

　　精密吸取同一供试品(批号E06002)溶液，于0、4、8、12、18、24 h分别进样，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱峰面积。结果RSD值为1.60%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

　　2.9 重复性试验

　　取同一批号(批号F03002B)小儿清热利肺口服液6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定。结果绿原酸含量的RSD值为0.19%(n=6)，表明本方法重复性良好。

　　2.10 加样回收率试验

　　精密吸取小儿清热利肺口服液(批号I11002B)适当稀释后的药液共6份(绿原酸质量浓度为0.842 7 mg·mL-1)，分别加入绿原酸对照品溶液适量，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下方法测定绿原酸的含量，计算回收率。结果见表1。表1 加样回收率试验结果

　　2.11 样品测定

　　取小儿清热利肺口服液3批 (批号E06002、F03002B、F10001B)，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定，以外标法计算绿原酸的含量。结果3个批号样品的质量浓度分别为2.331、1.861、1.928 mg·mL-1，RSD值依次为0.48%、1.09%和0.77%。

　　3 讨论

　　3.1 绿原酸为金银花的特征有效成分。本实验在去除金银花的阴性对照液中检测出较高含量的绿原酸(见图2)，并通过实验发现绿原酸在牛蒡子中含量较高。曾有关于在牛蒡叶中提取绿原酸的文献报道[3]，但未见牛蒡子中检测出绿原酸的报道。本研究这一发现不仅提高了牛蒡子药材的可利用度，同时也可作为其质量控制的指标之一。

　　3.2 对绿原酸对照品溶液在200～400 nm处进行紫外光谱扫描检测，结果显示绿原酸在217、240、327 nm处均有最大吸收，选择干扰较少的327 nm作为检测波长。

　　3.3 对不同比例的乙腈H3PO4水溶液[4]作为流动相的分离效果进行了考察，发现当二者的体积比为10∶90，绿原酸与相邻杂质峰分离效果最好，保留时间适中。H3PO4水溶液的体积分数为0.4%时，峰形对称。因此，选择乙腈体积分数0.4% H3PO4水溶液(体积比10∶90)作为流动相。

　　3.4 小儿清热利肺口服液为11味中药组成的大复方，成分非常复杂，因而，供试品制备方法的选择难度较大。曾尝试用甲醇对样品液进行超声提取，提取液直接进样检测。检测结果表明，绿原酸峰与其它杂质峰达到基线分离耗时较长，且由于目标峰后还有较多杂质峰，为不干扰下一样品的检测必须等待90 min以上才可进样。为改善分离效果，对甲醇提取液采用中性氧化铝柱柱与大孔吸附树脂[5]进行纯化，结果发现，二者分离纯化的效果并不理想，且操作繁琐。故尝试使用溶剂萃取法对样品进行处理，并对乙酸乙酯与水饱和正丁醇的萃取[2]效果进行了比较。结果表明，2种溶剂所得萃取液的色谱图基本相同，峰形、峰时一致，但乙酸乙酯萃取液的峰面积较小，说明乙酸乙酯萃取时绿原酸损失较多，其主要原因是绿原酸微溶于乙酸乙酯。因此，确定样品采用水饱和正丁醇萃取，不仅能有效去除杂质，且绿原酸损失较少，操作简便、快速。

　　对萃取溶剂用量与萃取次数考查结果表明，20倍水饱和正丁醇萃取2次与15倍水饱和正丁醇萃取3次所得萃取液中绿原酸的含量较低;10倍水饱和正丁醇萃取3次较20、30倍水饱和正丁醇萃取3次所得萃取液中绿原酸的含量低;10倍水饱和正丁醇萃取4次所测得绿原酸含量与20、30倍水饱和正丁醇萃取3次的含量基本一致，且高于5倍水饱和正丁醇萃取4次的含量。因此，确定水饱和正丁醇用量为10倍量，萃取次数为4次。

　　3.5 本研究建立的绿原酸含量测定方法简便快速、分离度好、灵敏度高，可用于小儿清热利肺口服液的质量控制。

参考文献

　[1] 易明娟，谢子清，谭亿明，等.清热利肺口服液的药理研究[J].成都中医药大学学报，1997，20(4):35-39.

　　[2] 刘军海，裘爱泳，任惠兰.绿原酸提取与纯化分离方法研究进展[J].粮食与油脂，2007，(7):42-45.

　　[3] 杨丽芬.牛蒡叶绿原酸提取工艺、分离纯化及对病原真菌的活性研究[D].山东大学，2007.

　　[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部[M].北京:中国医药科技出版社，2010:205.

　　[5] 李欣荣，曹志胜，柏茗.中药制剂中绿原酸测定样品预处理方法研究[J].中国中药杂志，1997，22(4):220-221.