LHRHPE40与胃癌细胞结合的特异性

　　　　 作者：姜洋 杜珍武 刘铜军 吴广谋 朱平

【摘要】 目的 观察LHRHPE40与LHRH的竞争实验，验证LHRHPE40是否保留与胃癌组织上的LHRH受体结合的特性。方法 LHRHPE40与胃癌组织的免疫组化(SP法)实验，LHRHPE40与LHRH在胃癌组织上的竞争性抑制实验。结果 阳性染色者为细胞膜及胞膜浆内呈现棕黄色;细胞膜及细胞质无染色为阴性。结论 免疫毒素LHRHPE40与胃癌细胞结合存在特异性，与LHRH在胃癌细胞上的产生竞争性抑制。

【关键词】 LHRHPE40;胃癌细胞

　　促黄体激素释放激素绿脓杆菌外毒A(LHRHPE40)是通过融合蛋白技术生产的由PE40和LHRH组成免疫毒素〔1〕的嵌合蛋白。某些肿瘤细胞表面过多表达LHRH受体〔2，3〕，可以通过LHRH将PE40靶向地带到肿瘤细胞表面，从而达到杀伤肿瘤细胞的目的，但激素与受体的结合受到了很多因素的制约〔4〕;对正常组织不结合或仅少量结合。

　　本实验观察LHRHPE40与正常胃组织及各种病理型胃癌的结合能力，在有LHRH受体的胃癌组织上通过LHRHPE40与LHRH的竞争抑制实验，验证LHRHPE40是否保留与胃癌组织上的LHRH受体结合的特性，从而明确LHRHPE40对肿瘤的目标性，并验证LHRHPE40是否能进入细胞质从而发挥细胞毒性作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 人胃癌细胞系(BGC823)由长春基因工程药物研究所提供; LHRHPE40由长春基因工程药物研究所提供;LHRH培养基购于上海子能公司;兔抗PE40抗体购自长春基因工程药物研究所;羊抗兔IgG生物素购自华美生物公司。

　　1.2 LHRHPE40与胃癌组织的免疫组化(SP法)实验 石蜡切片脱蜡和水化后，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)冲洗3次，每次3～5 min。兔抗PE40抗体500倍稀释，37℃ 1 h。羊抗兔IgG生物素室温30 min。每张切片加2滴新鲜配制的二氨基联苯胺(DAB)液，显微镜下观察5～10 min，中性树胶封固。

　　1.3 LHRHPE40与LHRH在胃癌组织上的竞争性抑制实验 实验步骤同上。同时，设不加一抗的阴性对照及仅加500 μg/ml 10倍稀释液的阳性对照。实验组：500 μg/ml的LHRHPE40 50倍稀释后加入LHRH，使LHRH终浓度为200 μg/ml，37℃ 1 h，PBS冲洗(5 min×3次)。

　　1.4 细胞膜的制备 从培养液中离心细胞，细胞计数。用分析缓冲液洗涤细胞。在冰浴下用玻璃研磨器粉碎细胞后，于倒置显微镜下观察细胞破碎程度，完全破碎后，离心弃沉淀，取上清离心，得到较纯的细胞膜制剂，蛋白测定采用Lowry氏方法，以人血清清蛋白做标准曲线。

　　1.5 LHRHPE40标记及纯化 称取1 mg蛋白多肽溶于0.5 ml氯仿中，取50 μl(100 μg)加至试管底部，用氮气吹干，加不含保护剂的LHRHPE40半成品0.4 ml(5 mg/ml)，加入Na125I 5 mCi，室温反应12 min，反应过程不断摇动，使之反应充分。125ILHRHPE40标记混合物利用Sepharyl S200 HR凝胶柱(1×50 cm)分离纯化，0.05 mol/L PBS流速为12 ml/h，收集各管，取放射性强度最高的管进行试验：1.2 mCi/2.5 ml/管，蛋白浓度0.089 μg/ml。

　　1.6 结合试验 取结合试验饱和曲线拐点处放射性标记物γ记数单位100 μl，加入10倍稀释的细胞膜悬液100 μl(含蛋白量为2.5 μg)和不同稀释浓度的非放射性标记的LHRH纯品(1×105mol/L～1×1010 mol/L)。用0.1%的胎牛血清(BSA)溶液浸泡2 h的0.45 μm纤维素过滤膜抽滤，真空抽干5 min后，在FT613自动125I放免测量仪上计数。

　　2 结 果

　　2.1 LHRHPE40与胃癌组织结合特异性 SP阳性细胞胞膜及胞浆呈棕黄色染色，表明生物素标记的LHRHPE40可进入胞浆发挥生物学作用，即胃癌细胞膜上表达LHRH受体。LHRHPE40在正常胃组织无特异性染色，偶见阳性细胞，为正常胃组织对LHRHPE40的非特异性结合。对不同病理类型的胃癌细胞胞浆内均可见棕黄染色，多数LHRHPE40阳性胃癌组织细胞膜及胞浆均着色，少数细胞仅胞膜着色。由于病理类型的不同，细胞膜上受体表达量的不同，胞浆棕黄色的表达量也有所不同。胃癌组织与正常胃组织比较，其细胞质黄染阳性细胞明显增加(P&<0.01)，证实LHRHPE40可通过肿瘤细胞胞膜进入细胞质。从胞浆染色和阳性细胞计数显示，分化程度低的胃癌组织胞浆中LHRHPE40高于分化程度高的组织。由于LHRHPE40是通过与LHRH受体结合进入细胞内，因此表明印戒细胞癌及低分化腺癌较高分化腺癌LHRH受体在在胃癌组织中的表达量高。见图1，图2。

　　2.2 LHRHPE40与LHRH在胃癌组织上的竞争性抑制 每组加入LHRHPE40的胃癌组织分别加入终浓度为20 μg/ml LHRH。LHRH+LHRHPE40与仅加入LHRHPE40的腺癌组织比较明显变淡，染色阳性的细胞数明显减少(P&<0.01)。证实LHRHPE40和LHRH与胃癌组织的结合存在着竞争性抑制，LHRHPE40是与胃癌表面LHRH受体相结合进入胞浆内，同时LHRHPE40保持了LHRH的与其受体结合的空间结构及结合位点。见图2。

　　2.3 125ILHRHPE40和LHRH与细胞膜结合的竞争性抑制曲线及其亲和常数 标记与非标记的配体因竞争同一受体而导致标记配体结合成反比，而得到一条竞争抑制曲线，以此可以鉴定某一特异性受体是否存在。125ILHRHPE40与结肠癌Lovo和胃癌BGC823细胞膜的结合是随着非标记物性LHRH的增加而减少，在LHRH浓度分别达到1×10-6mol/L和1×10-5mol/L时，其结合量达到10%以下。显示了专一的竞争抑制。用Scatchard法作图得到一条直线，从而计算出Lovo和BGC823细胞表面受体与LHRHPE40结合的亲和常数。见图3。

　　图1 各组细胞LHRH受体表达(×400)图2 不同类型胃癌组织细胞内染色阳性率图3 ILHRHPE40与LHRH的竞争抑制曲线

　　3 讨 论

　　LHRHPE40是由导向部分LHRH蛋白和毒性部分绿脓杆菌外毒素蛋白共同组成的免疫毒素。其作用原理是通过导向部分的LHRH蛋白和癌细胞表面的相应受体结合，然后由绿脓杆菌外毒素通过跨膜转运至细胞内特异性杀死癌细胞。因此，其导向部分的LHRH蛋白能否和癌细胞表面LHRH蛋白受体特异性结合并进入胞浆就成为治疗的关键。

　　本研究通过SP染色显示，生物素标记的LHRHPE40可通过胃癌细胞膜受体进入胞浆，在细胞质内大量表达，且可见胞浆中存在阳性表达的LHRHPE40。本研究通过对不同病理类型的胃癌阳性细胞进行计数及统计学分析显示，在分化程度低的胃癌组织中可见LHRHPE40的高表达，尤其印戒细胞癌和低分化腺癌胞浆内LHRHPE40表达量为著，分化程度高的肿瘤组织LHRHPE40表达量低(P&<0.001)。在加入拮抗剂LHRH后，与仅加入LHRHPE40实验组比较，其阳性表达的胃癌细胞数明显减少(P&<0.001)。因此可以证实，胃癌细胞表面存在大量高亲和力的LHRH受体，LHRHPE40与胃癌组织细胞膜上受体结合为特异性结合。可以看出LHRHPE40保留了与LHRH受体结合的分子结构，LHRHPE40可通过与肿瘤细胞表面LHRH受体相结合进入细胞质内。免疫毒素LHRHPE40分子上结合的PE40进入胞浆后，抑制肿瘤细胞蛋白质合成和促进细胞凋亡，杀伤肿瘤。因此，LHRHPE40在LHRH受体大量扩增的胃癌治疗方面可能有广泛的应用价值。本研究采用125I直接标记LHRHPE40进行放射性配基结合实验，竞争结合实验采用LHRH，实验结果表明125ILHRHPE40可以与胃癌、结肠癌肿瘤细胞膜蛋白特异性结合，并且可以被高浓度LHRH竞争性替代。

　　重组毒素具有较高特异性LHRHPE40能够和胃癌细胞表面的LHRH受体特异性结合，激素与其受体的结合受到很多因素的制约本实验组对于其他肿瘤细胞表面是否存在LHRH受体是否存在的研究正在进行中〔5〕。

参考文献

　1 Kreitman RJ.Recombinant fusion toxins for cancer treatment〔J〕.Expert Opin Biol Ther，2002;2(8):78591.

　　2 Wels W，Biburger M，Muller T，et al.Recombinant immunotoxins and retargeted killer cells:employing engineered antibody fragments for tumorspecific targeting of cytotoxic effectors〔J〕.Cancer Immunol Immunother，2004;53(3):21726.

　　3 Samama P，Cotecchia S，Costa T，et al.A mutationinduced activated state of the beta 2adrenergic receptor.Extending the ternary complex model〔J〕.J Biol Chem，1993;268(7):462536.

　　4 吕宝璋，卢 建，安明榜.受体学〔M〕.合肥:安徽科学技术出版社，2001:9191.

　　5 邓 欣，冯 昱，王 姿，等.重组毒素LHRHPE40与A549细胞表面LHRH受体结合的特异性及其细胞毒性〔J〕.中国药理学通报，2009;25(5)：6969.