低氧诱导因子1α在大鼠胶原诱导性关节炎中的表达及与血管生成的关系

　　　　 作者：王雯 陈森洲 徐雅娟 刘菁 陈建宏 钟毓娟

【摘要】 目的 制备牛Ⅱ型胶原诱导性大鼠关节炎(CIA)模型，探讨低氧诱导因子1α(HIF1α)、血管内皮生长因子(VEGF)在类风湿关节炎(RA)组织中的动态表达及其相关性作用。方法 50只SD大鼠，随机分为对照组与模型组。建立CIA模型，动态观察各项关节炎活动指标，于造模21、28、35、42 d取踝关节行HE染色及HIF1α、VEGF免疫组化染色，分析两者在CIA中的相关性及与关节炎活动指标、滑膜病理学评分之间的关系。结果 CIA大鼠关节滑膜层和滑膜下层均表达HIF1α、VEGF，第21天阳性表达量最高，随病程进展，表达逐渐下降，与滑膜病理学评分、滑膜增生评分及血管生成评分呈显著正相关，与炎症浸润评分无明显相关。结论 Ⅱ型胶原可成功诱导大鼠关节炎模型。HIF1α、VEGF在RA组织中的表达，与炎症严重程度呈明显正相关。HIF1α可能通过调控一系列下游靶基因，如VEGF等，促进滑膜增生及血管生成，影响RA的发生、发展。

【关键词】 Ⅱ型胶原诱导性关节炎;低氧诱导因子1α;血管内皮生长因子;滑膜

　　【Abstract】 Objective To establish the bovine collagenⅡ(CⅡ)induced arthritis (CIA) rat model and investigate the role of hypoxiainducible factor1α(HIF1α) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA). Methods 50 SD rats were randomly pided into normal and model group. The arthritis activity， pathological changes and expression of HIF1α and VEGF on synovium at different time were observed through HE and immunohistochemistry staining. The correlations of HIF1α and VEGF expression with the CIA arthritis activity indexes and pathological scores were analyzed. Results HIF1α and VEGF expressions were found on both lining and sublining area of synovium in CIA. The results of immunohistochemistry test showed that the expression of HIF1α and VEGF in synovial membrane was strongest on the 21st day， descent gradually with the prolonged disease course. The expression of HIF1α and VEGF correlated significantly with total pathological score， synovial hyperplasia score and angiogenesis score， but not with inflammation score. Conclusions Type Ⅱ collagen can induce arthritis in rats successfully. HIF1α may affect the pathogenesis of RA by promoting synovial hyperplasia and angiogenesis and regulating the lower course target genes just as VEGF.

　　【Key words】 Rheumatoid arthritis; Collagen Ⅱinduced arthritis; Hypoxiainducible factor1 α; Vascular endothelial growth factor; Synovium

　　类风湿关节炎(RA)是一种以慢性、对称性、多关节炎症为主要表现的自身免疫性疾病，其病因和发病机制迄今尚未明确。RA主要病理改变为滑膜炎，滑膜细胞的类肿瘤样增殖和大量炎症细胞的浸润，造成一个低氧微环境。低氧诱导因子1α(HIF1α)是介导细胞对缺氧微环境适应反应的关键性调控因子。研究发现，有核细胞缺氧时，均可引发HIF1α的高表达〔1〕。新生血管形成是造成滑膜炎、血管翳、关节破坏发生发展的一个重要环节，血管内皮生长因子(VEGF)是目前发现的最强有力促血管生成因子，直接参与新生血管形成。在RA中VEGF能够促进滑膜血管翳的形成、加重滑膜炎症及骨与关节软骨的破坏。本实验以大鼠Ⅱ型胶原诱导性关节炎(collagen Ⅱinduced arthritis，CIA)为模型，研究HIF1α在CIA中的表达及与新生血管生成之间的关系，初步探讨HIF1α在RA发病过程中的作用及与VEGF之间的关系，有助于了解HIF1α对于RA发生发展的调控作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物和试剂 雌雄各半健康SD大鼠50只(体重150～180 g)，动物级别：清洁级(SPF)，由本院动物中心提供，动物许可证号：SCXK桂20070001，购入本实验室适应性饲养1 w后进行实验。随机分为正常对照组，四个造模组，每组按照随机方式1～10进行编号。牛Ⅱ型胶原(美国Chondrex公司);不完全弗氏佐剂(IFA，美国Sigma公司);HIF1α单克隆抗体(美国Chemicon公司);VEGF单克隆抗体(美国Santa Cruz公司);二抗试剂盒(福州迈新公司)。

　　1.2 动物模型及关节标本制作 按照文献提供的方法稍加修改建立Ⅱ型胶原诱导型关节炎大鼠模型〔2〕，牛Ⅱ型胶原和IFA按1∶1充分乳化成终浓度为1 g/L乳剂。分4～5点在大鼠尾根部、背部皮内注射0.5 ml，对照组注射同量生理盐水，7 d后同法半量加强免疫一次。四个造模组大鼠分别于初次免疫后第21天、第28天、第35天、第42天处死;对照组大鼠于注射生理盐水后第42天处死。处死后大鼠取踝关节，乙二胺二乙酸(EDTA)脱钙2～3 w后，石蜡包埋、切片，行HE染色，SP免疫组织化学法检测HIF1α、VEGF蛋白的表达。

　　1.3 观察指标

　　1.3.1 大鼠一般状况及体重测定 造模前后动态观察大鼠体重、毛发色泽改变、神志、活动状态，食量变化及关节红肿情况，每周定期测量大鼠体重。

　　1.3.2 关节炎指数〔3〕(AI) 根据大鼠踝关节、跖趾关节、趾关节红肿程度及受影响关节数进行评分。0分：正常;1分：1个关节红肿;2分：2个及2个以上关节红肿;3分：踝关节以下足掌严重红肿;4分：包括踝关节在内的全部足爪红肿且不能负重。四肢分别进行评分，总和即为AI。AI&>5分为造模成功。

　　1.3.3 踝关节影像学观察 初次免疫后第21天、第42天经1%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，行踝关节X线摄片。摄片条件为40 kV。

　　1.3.4 免疫组织化学染色结果判定及评分 采用半定量记分法判定：①按阳性着色程度评分。0分为无着色，与背景色一致;1分为浅黄色，略高于背景色;2分为棕黄色，明显高于背景色;3分为棕褐色。②按阳性细胞所占比例评分。0分为阴性;1分为10%以下;2分为11%～50%;3分为51%～75%;4分为75%以上。③两者乘积判定阳性结果。HIF1α阳性细胞为胞浆或胞核呈棕黄色或棕褐色，VEGF阳性细胞为胞浆呈棕黄色或棕褐色。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行处理，正态分布资料用x±s表示;多组间均数的比较采用单因素方差分析;半定量资料两组间比较采用MannWhitney秩和检验;对两组数据间的相关性进行Spearman等级相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠CIA模型的建立 模型组40只大鼠在首次给药后第12天起，有26只出现踝、跖趾关节以及趾关节红肿。对照组未出现明显关节红肿。造模成功率为65%(26/40)。

　　2.2 一般情况 造模期间动物无死亡，对照组大鼠体重逐渐增加、精神良好、活动自如。模型组给药12 d后开始出现不同程度后足爪红肿、皮温升高、脱毛、精神怠倦、体重增长减慢甚至下降、饮食饮水量下降。给药48 h后注射部位出现炎性小溃疡，红肿明显，逐渐加重并破溃，7～10 d破溃处形成硬痂，而后脱落溃疡愈合。

　　2.3 CIA大鼠AI变化 随着炎症的发展，AI值逐渐增加。初次免疫12 d及以后各时间点AI值均与正常组(0.40±0.52)比较有差异(P&<0.05)，第21天达峰值(10.63±1.06)，之后第28、35天(9.20±0.84，7.43±1.13)逐渐下降，第42天(6.33±1.03)降至最低值，但仍高于正常组(均P&<0.05)。正常对照组AI值均小于1。

　　2.4 X线改变 对照组踝关节软组织无肿胀，骨质无破坏，足趾关节间隙清楚。模型组免疫后第21天，踝关节周围软组织肿胀，足趾关节间隙模糊、狭窄及融合等表现。第42天踝关节骨骼结构排列紊乱，关节间隙不清，可见囊性骨吸收和骨侵蚀。提示模型组发生慢性侵蚀性关节炎。见图1。

　　2.5 大鼠踝关节病理学变化 正常大鼠滑膜由1～2层扁平滑膜细胞组成，无炎细胞浸润及血管增生，关节结构完整，软骨层较厚，表面光滑。CIA组大鼠初次免疫后21 d时滑膜细胞层数增至10～15层，增生滑膜形成血管翳，炎细胞浸润;42 d侵蚀软骨及骨，关节软骨可见坏死脱落、纤维化，广泛炎细胞浸润，伴有不同程度的软组织水肿，滑膜下层大量纤维增生及新生血管形成，呈肿瘤性侵袭性生长。见图2。

　　2.6 CIA大鼠滑膜HIF1α、VEGF蛋白的表达 正常对照组均未见HIF1α、VEGF蛋白表达。CIA模型组HIF1α、VEGF表达增强，HIF1α在细胞核及细胞质中均表达，VEGF表达于细胞浆中。从免疫组化结果可以看出不仅滑膜细胞，滑膜下层巨噬细胞、部分血管内皮细胞、成纤维细胞等也表达HIF1α、VEGF。HIF1α表达与AI呈正相关(r=0.725，P&<0.01)， HIF1α与VEGF蛋白表达情况进行相关回归分析，呈明显正相关(r=0.75，P&<0.01)。两者均在第21天、第28天滑膜细胞阳性表达量及程度最高，随病程进展，阳性表达量及程度逐渐下降。见图3，表2。图1 大鼠踝关节X线检查 图2 大鼠踝关节腔病理学变化 HE染色　图3 模型组关节滑膜组织HIF1α和VEGF表达(DAB，×400)表2 各组大鼠滑膜HIF1α、VEGF蛋白表达的免疫组化评分

　　3 讨 论

　　CIA是目前用于研究RA较为理想的动物模型，其免疫机制、关节病理改变、临床表现和实验室指标与人类RA接近，如滑膜增生、血管翳形成，以及随之出现的软骨及骨破坏、侵犯肢体远端关节及对胶原的体液免疫反应、与MHC的相关性等〔4〕。RA主要病理改变为滑膜炎，滑膜细胞增殖具有锚着非依赖性生长、失去接触抑制、凋亡减少及侵蚀性等类似肿瘤生长的特点。滑膜细胞这种类肿瘤样增殖和大量炎症细胞的浸润，导致局部毛细血管氧弥散距离及耗氧量的增加，进而造成一个低氧微环境。HIF1α具有广泛的靶基因谱，其中既包含与炎症发展、细胞代谢、血管生成相关的基因，也涉及与肿瘤生长、转移有关的基因，已发现超过60种基因受其调控〔5〕。Cramer〔6〕等在体外试验中发现将髓系细胞系的HIF1α基因敲除后，能消除大鼠体内出现的炎症。体内试验也证明在髓细胞HIF1α基因缺失的急、慢性炎症动物模型中，HIF1α基因缺失组较野生型组疾病严重程度降低。均提示HIF1α高表达可加重炎症的程度。本实验提示滑膜HIF1α表达与CIA大鼠关节炎病变密切相关。体内外实验已证实，抗滑膜血管生成能有效减轻RA病情〔7〕。Tang等〔8〕通过对肿瘤内皮细胞敲除HIF1α基因后，抑制了VEGF的表达及实体瘤的血管生长，证实了HIF1α调控VEGF表达的功能。本实验发现，CIA大鼠中VEGF表达显著升高，造模后21～28 d模型组关节肿胀程度最显著，此时VEGF的表达也比其他时间点明显升高。且HIF1α与VEGF蛋白表达呈显著正相关，提示HIF1α与CIA大鼠滑膜血管生成密切相关，可能是其参与RA发病最重要的机制之一。

　　本实验结果显示CIA大鼠关节滑膜表达HIF1α，并与关节炎病情活动、滑膜增生及血管生成密切相关，提示HIF1α很可能在RA中通过调控一系列下游靶基因，影响滑膜炎的发生、发展。由于RA是“难治之症”，因此，探究HIF1α在RA的发病机制中所发挥关键作用，很可能是重要的治疗靶点。可通过对HIF1α进行阻断，从而阻止滑膜炎的发生、发展。有关HIF1α在RA中的具体作用机制有待进一步研究。

参考文献

　1 Westra J，Brouwer E，Bos R，et al.Regulation of cytokineinduced HIF1alpha expression in rheumatoid synovial fibroblasts〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2007;1108：3408.

　　2 Wakamatsu K，Nanki T，Miyasaka N，et al.Effect of a small molecule inhibitor of nuclear factorκB nuclear translocation in a murine model of arthritis and cultured human synovial cells〔J〕.Arthritis Res Ther，2005;7(6)：134859.

　　3 Baharav E，Mor F，Halpern M，et al.Lactobacillus GG bacteria ameliorate arthritis in Lewis rats〔J〕.J Nutr，2004;134(8):19649.

　　4 Zhou J，Xiao C，Zhao L，et al.The effect of triptolide on CD4+ and CD8+ cells in Peyer′s patch of SD rats with collagen induced arthritis〔J〕.Int Immunopharmacol，2006;6(2)：198203.

　　5 Hashimoto A，Tarner IH，Bohle RM，et al.Analysis of vascular gene expression in arthritic synovium by lasermediated microdissection〔J〕. Arthritis Rheum，2007;56(4):1094105.

　　6 Cramer T，Yamanishi Y，Clausen BE，et al.HIF1alpha is essential for myeloid cellmediated inflammation〔J〕.Cell，2003;112(5)：64557.

　　7 Szekanecz Z，Gaspar L，Koch AE.Angiogenesis in rheumatoid arthritis〔J〕.Front Biosci，2005;10:173953.

　　8 Tang N，Wang L，Esko J，et al.Loss of HIF1alpha in endothelial cells disrupts a hypoxiadriven VEGF autocrine loop necessary for tumorigenesis〔J〕.Cancer Cell，2004;6(5):48595.