作者：张东 邬国栋 张述禹 王玉华 杨玉梅
【摘要】 目的：研究诃子提取物含药血清对h3O2所致心肌细胞损伤的保护作用。方法：采用h3O2处理培养心肌细胞，造成氧化应激模型，通过检测细胞培养液中LDH、CK漏出量、MDA含量和SOD活性反映诃子提取物含药血清对h3O2氧化模型的影响。结果：与模型组比较，诃子提取物含药血清能显著减少LDH、CK漏出量（P＜0.05，P＜0.01）；降低培养液中MDA含量（P＜0.05，P＜0.01），升高SOD活性（P＜0.01）。结论:诃子提取物含药血清可减轻h3O2对心肌细胞的损伤程度，对心肌细胞具有保护作用，其机制可能与稳定细胞膜和抗氧化有关。
【关键词】 诃子;过氧化氢;心肌细胞培养；血清药理学
Abstract Objective: To investigate the protective effects of the Terminalia chebula extract serum on myocardial cells injury in cultured rats induced by h3O2. Methods: Oxidative damage model were induced by h3O2， the leakage level of lactidehydrogenase (LDH)， creatine kinase (CK)， the content level of methylenedioxyamphetamine (MDA)，the activity of superoxide dismutase (SOD) were measured in medium to observe the effects of the Terminalia chebula extract serum on myocardial cells injury in cultured rats induced by Hydrogen peroxide(h3O2). Results: Compared with the model control， the content of LDH， CK， MDA decreased significantly（P＜0.05，P＜0.01） and the activity of SOD increased significantly（P＜0.01）. Conclusion: the Terminalia chebula extract serum can mitigate injury of Hydrogen peroxide(h3O2) on myocardium ，it has protecting effect on damaged myocardium. It is suggested that the protecting mechanism may be related to stabilizing membrane and its antioxidant properties.
Key words Terminalia chebula; Hydrogen peroxide; Cardiac myocyte culture; Serum pharmacology
诃子又名诃黎、诃黎勒、随风子，为使君子科植物诃子（Terminalia chebula Retz.）或绒毛诃子（Terminalia chebula Retz.Var.tomentella Kurt.）的干燥成熟果实。诃子常应用在藏医学、蒙药中，是蒙药中应用比例最大、功用最广泛的药物，被称之蒙药之王[1]。诃子果实含鞣质，其成分为诃子酸、诃黎勒酸、1，3，6-三没食子酰葡萄糖等，此外还含有阿拉伯糖、诃子素、三萜类等，具有抗菌、抗氧化、抗诱变、抗动脉粥样硬化、强心等作用，但其对心脏的作用机制现未完全清楚。本实验采用血清药理学方法，在细胞水平利用h3O2损伤培养乳鼠心肌细胞，探讨诃子对心肌细胞损伤的保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
Wistar大鼠乳鼠（1～4 d），Wistar大鼠（体重200±20 g），均购自内蒙古大学实验动物中心，合格证号：SCXK（蒙）2002-0001。
1.2 主要药品与试剂
诃子购自呼和浩特市凯蒙大药房，经内蒙古医学院药学院植化教研室庞秀生教授鉴定为使君子科植物诃子（Terminalia chebula Retz.）或绒毛诃子（Terminalia chebula Retz.Var. tomentella Kurt.）的干燥成熟果实。RPMI-1640、胎牛血清购自Gibco公司，过氧化氢（Ｈ2Ｏ2）购自Sigma公司，乳酸脱氢酶试剂盒、肌酸激酶试剂盒购自北京北化康泰临床试剂有限公司，丙二醛试剂盒、超氧化物歧化酶试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.3 主要仪器
MCO-15AC型CO2培养箱(日本三洋)，CJ-2F型医用净化工作台(苏州市金燕净化设备有限公司)，SCOUT-Ⅱ型半自动生化分析仪（意大利MENARINI公司）。
1.4 方法
1.4.1 诃子提取物的制备
诃子果实粉碎后用70 %丙酮提取3次，滤液合并后减压回收丙酮，用乙醚和乙酸乙酯分别萃取，挥干[2]。
1.4.2 乳鼠心肌细胞原代培养
无菌迅速取出出生1～4 d的Wistar乳鼠的心脏，用PBS液充分洗净血液并去除多余组织，将心脏剪成约1 mm3的小块，加入5 mL 37 ℃孵育的0.08 %胰蛋白酶，在恒温磁力搅拌器上、37 ℃水浴消化8 min；首次消化所得的消化液弃之不用，再加入8 mL胰蛋白酶，依上述条件消化；将消化液转移入50 mL离心管中，并加入等量培养基以终止消化，余下的组织块中再加入8 mL新的胰酶继续消化，重复多次，直至心肌组织全部消化；消化液以1 000 r/min离心10 min，弃上清液，再加入3 mL培养基混悬细胞沉淀，离心后弃上清液，再加培养基混悬；将此细胞悬液转移入培养瓶中，于37 ℃、5 % CO2孵箱中静置120 min，差速贴壁以减少成纤维细胞的污染；收集培养瓶中的上清液，计数后稀释，接种入96孔培养板，继续培养[3]。
1.4.3 含药血清的制备
将体重200±20 g Wistar大鼠按体重分层随机分成5组，每组5只。第1组为对照组，灌胃蒸馏水1 mL/100 g体重;第2～5组为诃子提取物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组，灌胃剂量分别为90.0 mg/100 g体重、60.0 mg/100 g体重、30.0 mg/100 g体重、6.0 mg/100 g体重；以上各组每日灌胃2次，连续3天。末次给药前12 h禁食、不禁水。末次给药后1 h无菌腹主动脉取血，静置过夜后，于次日3 000 r/min离心15 min，分离含药血清，-20 ℃冰箱保存备用[4]。
1.4.4 损伤模型的建立和实验分组
细胞培养实验中，每隔48 h换液一次，待有大部分心肌细胞搏动时开始实验。按随机原则分为6组：对照组：在培养基中加入对照血清，使对照血清的体积百分比含量为15 %，用溶有对照血清的培养基培养细胞30 h；模型组：方法同对照组，用含15 %对照血清的培养基培养24 h，然后加入h3O2，使其终浓度为2 mmol/L，继续培养6 h；诃子提取物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ血清组：在培养基中加入含药血清，使含药血清的体积百分比含量为15 %，用溶有含药血清的培养基培养细胞24 h，然后加入h3O2，使其终浓度为2 mmol/L，继续培养6 h。
1.4.5 乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的测定
均参照试剂盒说明书操作，测定波长分别为440 nm、340 nm、532 nm、550 nm。
1.4.6 数据处理与统计
数据用SPSS11.5统计软件进行方差齐性检验、单因素方差分析（one-way-ANOVA），组间比较用LSD法，实验结果以x±s表示。
2 结果
2.1 提取物含药血清对h3O2损伤心肌细胞LDH、CK的影响
与对照组相比，模型组的心肌细胞LDH、CK漏出量显著增多（P＜0.01）；与模型组比较，含药血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ组可以显著减少LDH漏出量（P＜0.05，P＜0.01），同时含药血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组还可以显著减少CK漏出量（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表1。表1 提取物含药血清对h3O2损伤心肌细胞LDH、CK的影响（略）
2.2 提取物含药血清对h3O2损伤心肌细胞MDA、SOD的影响
与对照组比较，模型组MDA生成显著增多、SOD活性显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，含药血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组可以减少心肌细胞培养液中MDA的含量（P＜0.05或P＜0.01），含药血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组显著升高SOD的活性（P＜0.01）。结果见表2。表2 提取物含药血清对h3O2损伤心肌细胞MDA、SOD的影响（略）
3 讨论
中药血清药理学是近10余年来才兴起的一种实验方法，它是将中药或中药复方经口给动物灌服一定时间后采集动物血液，分离血清，用此含有药物成分的血清进行体外实验的方法。由于它同用中药粗制剂直接进行的体外实验相比，既具有体外实验条件可控性强、药物效应易于检测、可深入揭示药物作用机理的优点，又能够防止中药粗制剂本身的理化性质对实验的干扰[5]，而且比较接近药物在体内环境中产生药理效应的真实过程，其原有成分或在体内转化为活性成分，或通过第二信使而间接起作用等都可以通过血清药理学反映出来，理论上更具备科学性、真实性[6]。本实验将血清药理学方法引入了蒙药药理的研究中，探讨蒙药诃子提取物的含药血清对损伤心肌细胞的影响。
Ｈ2Ｏ2是体内氧化代谢的中间产物，同时又是一种活性氧。Ｈ2Ｏ2浓度积累到一定程度会对机体细胞产生损伤作用，如Ｈ2Ｏ2可诱发脂质过氧化反应，使ＭＤＡ生成增多，质膜通透性增加，引起细胞损伤和细胞死亡等[7]。
本实验利用外源性h3O2直接处理原代培养心肌细胞，建立氧化损伤模型，以心肌细胞培养基中LDH、CK漏出量作为心肌细胞损伤的指标。LDH、CK是心肌细胞胞内酶，少量漏出即提示细胞膜通透性增高，漏出量的多少反映细胞膜的受损程度[8]。本实验结果提示，诃子提取物含药血清可显著减少h3O2损伤心肌细胞培养基中LDH、CK漏出量，说明提取物含药血清可减轻细胞膜的损伤程度，降低细胞膜通透性，具有膜稳定作用。
MDA是脂质过氧化反应的终产物，它的含量可间接反映机体细胞受自由基损伤的程度[8]。SOD是一种存在于细胞液中的抗氧化酶，它可清除超氧阴离子，保护机体免受超氧阴离子损伤，其值高低间接反映了机体清除氧自由基的能力[9]。本实验结果提示，诃子提取物含药血清可明显降低MDA含量、升高SOD活性，说明提取物含药血清可能通过增强机体对氧自由基的清除能力，减轻细胞膜脂质过氧化损伤，从而发挥对心肌细胞膜的保护作用。上述实验结果说明诃子提取物含药血清对损伤心肌细胞的保护作用可能与抗氧自由基损伤有关系。
综上所述，诃子提取物含药血清对h3O2损伤心肌细胞具有保护作用，其机制可能与稳定细胞膜和抗氧化有关。
参考文献
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