血管内皮生长因子基因对大鼠动脉性阴茎勃起功能障碍的治疗作用

　　　　 作者：宋志宇 张家颖1 张纪周1 孙珉丹 张永瑞 洪敏 赵忠文

【摘要】 目的 探讨阴茎海绵体内注射血管内皮生长因子(VEGF)基因对大鼠动脉性阴茎勃起功能障碍(ED)的治疗作用。方法 通过超速离心纯化pcDNA3.0 和 pcDNAVEGF165质粒，选取雄性Wistar大鼠32只，分为4组，每组8只。Ⅰ组，双侧髂内动脉结扎组;Ⅱ组，双侧髂内动脉结扎后阴茎海绵体内注射pcDNA3.0质粒组;Ⅲ组，双侧髂内动脉结扎后阴茎海绵体内注射注射pcDNAVEGF165质粒组;Ⅳ组，假手术组。饲养4 w后，对4组大鼠注射阿朴吗啡(APO)行电刺激海绵体神经实验(ICP)，评价其勃起功能。结果 在阿朴吗啡实验中Ⅰ组、Ⅱ组大鼠的勃起次数明显少于Ⅲ组、Ⅳ组(P&<0.05);大鼠打哈欠次数各组之间无变化(P&>0.05)。在电刺激海绵体神经实验中Ⅰ组、Ⅱ组ICP增幅明显低于Ⅲ组、Ⅳ组(P&<0.05)。结论 阴茎海绵体内注射VEGF基因对大鼠动脉性ED有一定的治疗作用。

【关键词】 血管内皮生长因子;基因治疗;勃起功能障碍;大鼠

　阴茎勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED)在老年男性较常见。一项中国1 160例ED 患者统计资料显示，器质性ED患者接近40%，其中血管因素仍是最常见的，随年龄增加，其器质性病因增多，ED 程度加重〔1〕。而常规的治疗方法对血管性ED的治疗效果很差，目前基因治疗已成为ED治疗的发展方向。本研究将携带血管内皮生长因子(VEGF)基因的表达质粒注射到大鼠阴茎海绵体内，并对大鼠的阴茎勃起情况进行观察，旨在证实VEGF基因治疗动脉性ED的可行性。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要材料 雄性Wistar大鼠，由吉林大学医学院实验动物中心提供。大肠埃希菌DH5A、质粒pcDNA3.0 、pcDNAVEGF165由吉林大学白求恩医学院提供。阿扑吗啡(APO)购自美国Sigma公司。

　　1.2 质粒的制备与纯化 本实验采用的pcDNAVEGF165质粒，是将含有信号肽人的VEGF165质粒cDNA基因插入到pcDNA3.0表达质粒构建而成的，经碱裂解法提取质粒，超速离心纯化后得到。

　　1.3 动脉性ED大鼠模型的建立 取成年雄性Wistar 大鼠32只，重350～450 g。大鼠麻醉后固定，下腹正中切口，显露髂血管，在双侧髂内动脉的主干处结扎。假手术组采用同样切口、分离技术，但不结扎髂内动脉。

　　1.4 大鼠阴茎海绵体内注射质粒 结扎双侧髂内动脉之后，立即用胰岛素注射器将单一剂量的药物注射到海绵体组织内。pcDNA3.0和pcDNAVEGF165质粒各100 μg分别溶于200 μl磷酸盐缓冲液(PBS，含20%蔗糖)中，注射的终体积是200 μl。对照组仅注射溶媒。大鼠分为4组，每组8只，Ⅰ组双侧髂内动脉结扎;Ⅱ组双侧髂内动脉结扎后阴茎海绵体内注射pcDNA3.0质粒;Ⅲ组双侧髂内动脉结扎后阴茎海绵体内注射注射、pcDNAVEGF165质粒;Ⅳ组假手术组。

　　1.5 APO实验 在术后1个月，按照Heaton等〔2〕方法对每只大鼠进行APO实验。选择一间安静的房间，在保证录像清晰情况下，尽量使光线暗淡，将大鼠放在实验观察笼子中适应环境10 min。于大鼠颈后松弛皮肤皮下注射APO(5 ml/kg，APO的终剂量100 μg/kg，用维生素C 0.5 mg/kg盐水溶液作为溶媒)。录像记录30 min，记数打哈欠次数和勃起次数。当出现骨盆前推并跟随直立姿态露出阴茎头及远段阴茎体，记录为勃起1次。

　　1.6 电刺激海绵体神经实验(ICP)的测定 术后1个月，麻醉并固定大鼠，下腹部正中切口，在手术显微镜帮助下进行手术。通过颈部正中切开行颈动脉插管持续监测动脉压;在前列腺两侧区域暴露出和鉴定出海绵体神经，将不锈钢双极钩状电极围绕在海绵体神经上，准备电刺激;将一只装满250 U/ml肝素溶液并与导管相连接的23gauge针头插进海绵体脚，准备用于监测海绵体内压。两条压力通路与两台压力转换器连接，直接与微机控制的记录仪连接，来测量并记录全身动脉压及海绵体内部的压力;采用与微机刺激输出导线相连接电极来进行电刺激，每只电极直径0.2 mm，两只电极分开1 mm。微机可以发放单相矩形脉冲波，刺激参数为1.0 mA，频率20 Hz，波幅0.2 ms，持续1 min。刺激每一侧海绵体神经，15 min休息期后(压力回到基线)，进行下一次电刺激〔3〕。

　　1.7 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行处理，数据以x±s表示，采用t检验，进行两样本均数比较。

　　2 结 果

　　2.1 APO实验结果 注射APO后，可观察到大鼠阴茎勃起和打哈欠情况，勃起时，绝大多数大鼠用2只前爪抓住阴茎，并用口舔含阴茎，打哈欠定义为不自觉的打张嘴做呼吸运动，不伴有功能性咀嚼运动。

　　2.1.1 阿扑吗啡诱导的大鼠阴茎勃起次数的比较 Ⅰ组阴茎勃起次数为0.50±0.76，Ⅱ组为0.43±0.79，Ⅲ组为1.63±0.92，Ⅳ组为3.25±1.67。两组之间平均数值行t检验：Ⅰ组与Ⅱ组之间比较，t=0.45，P&>0.05，无统计学意义;Ⅰ组与Ⅲ组之间比较，t=2.37，P&<0.05，有明显统计学差异;Ⅰ组与Ⅳ组之间比较，t=3.87，P&<0.002，有明显统计学差异;Ⅱ组与Ⅲ组之间比较，t=2.26，P&<0.05，有明显统计学差异;Ⅱ组与Ⅳ组之间比较，t=4.08，P&<0.001，有明显统计学差异;Ⅲ组与Ⅳ组之间比较，t=2.41，P&<0.05，有明显统计学差异。

　　2.1.2 阿扑吗啡诱导的大鼠打哈欠次数的比较 Ⅰ组大鼠打哈欠次数为11.50±10.95，Ⅱ组为18.14±6.38，Ⅲ组为15.75±7.54，Ⅳ组为18.38±9.92。两组之间平均数值行t检验：各组之间比较，P&>0.05，无统计学意义。

　　2.2 ICP实验结果 电刺激海绵体神经实验结果，海绵体内压Ⅰ组为(11.78±14.13) mmHg，Ⅱ组为(17.91±7.59) mmHg，Ⅲ组为(41.79±13.67) mmHg，Ⅳ组为(73.17±18.21) mmHg。两组之间平均数值行t检验：Ⅰ组与Ⅱ组之间比较，t=0.95，P&>0.05，无统计学意义;Ⅰ组与Ⅲ组之间比较，t=4.18，P&<0.001，有明显统计学差异;Ⅰ组与Ⅳ组之间比较，t=7.24，P&<0.001，有明显统计学差异;Ⅱ组与Ⅲ组之间比较，t=3.43，P&<0.005，有明显统计学差异;Ⅱ组与Ⅳ组之间比较，t=4.32，P&<0.001，有明显统计学差异;Ⅲ组与Ⅳ组之间比较，t=3.90，P&<0.002，有明显统计学差异。

　　3 讨 论

　　年龄是导致ED的独立危险因素，老年人ED多为器质性疾病，其中血管性(动脉、静脉)因素是主要病因。目前关于器质性ED治疗方法，主要有西地那非等药物口服、血管活性药物海绵体注射、阴茎血管手术及阴茎假体置入等。上述方法治疗ED取得了较好疗效，但同时存在一些不良反应、并发症及禁忌证〔4〕。

　　阴茎为一体表器官，很容易将目的基因及其产物转运到海绵体内;而且还可用止血带压迫阴茎根部来阻止基因及其产物进入全身血液循环，直至这些基因或其产物被靶细胞吸收，静止状态时，阴茎血流缓慢，可进一步增加基因及其产物的吸收。另外，阴茎血管的平滑肌更新很慢，因此一个新转染基因可起效数周至数月，一个ED患者每年接受3～4次基因注射，无需其他治疗便可保持其勃起功能。其次，基因治疗一般是生理过程，故推测不会引起阴茎异常勃起。最后阴茎海绵体内还存在缝隙连接，使阴茎成为一个功能性合胞体，因此，即使少数细胞转染目的基因，也会产生足够的有效生理效应。所以阴茎是接受转基因治疗的理想器官〔5〕。

　　目前ED的基因治疗所采用的目的基因主要有：ATP 敏感性钾离子通道〔6〕 、一氧化氮合酶〔7，8〕、超氧化物歧化酶〔9〕、VEGF〔10〕和胰岛素样生长因子1〔11〕等，以上基因都是细胞信号转导的信号分子和酶。本研究采用的是VEGF基因作为目的基因。VEGF是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，最主要的生物学作用就是刺激血管内皮细胞增殖以及促进新生血管的生成。

　　现有研究证明〔12〕：阴茎组织和细胞中，VEGF165编码表达的蛋白水平最高;向阴茎海绵体内注射VEGF蛋白，有助于动脉型ED大鼠勃起功能的恢复;VEGF165基因是目前少数几种被允许用于人自身的基因，在治疗下肢缺血疾病的Ⅰ期临床试验中，已经取得很好的疗效，证实了通过向人体肌肉内注射裸质粒DNA(phVEGF165) 是安全有效的，裸质粒DNA 在人体肌肉内可以表达，表达产物具有生物学功能，外源基因在人体肌肉内持续存在至少10 w以上。

　　小剂量的APO可以引起一组包括阴茎勃起、伸展肢体和打呵欠症候群，为研究勃起提供了标准的检查方法，这是通过中枢调节而发生作用。

　　本研究观察到4组大鼠打呵欠次数没有差异，证明了本实验大鼠ED病因是发生在阴茎，基因治疗对中枢没有影响。统计学分析4组大鼠阴茎勃起次数有差别，假手术组中，所有大鼠均出现了阴茎勃起，平均次数最高，在动脉结扎组及注射空质粒组，则很少发现阴茎勃起，在用VEGF治疗组中，可见到阴茎勃起次数有所增加，但明显少于假手术组。表明VEGF基因治疗后，动脉性ED大鼠阴茎勃起功能得到一定的恢复，但还没有达到正常。

　　为了更精确更客观反应阴茎勃起潜能的变化，本文进一步进行了电刺激海绵体神经的实验，通过观察海绵体内压的变化，对勃起功能进行定量评估。在假手术组中，通过电刺激可以见到典型的阴茎勃起反应。在双侧髂内动脉结扎组中，几乎未见到勃起，海绵体内压明显低于假手术组，进一步说明制造ED大鼠动物模型成功。在注射空质粒组，也得到了同样的结果。表明单纯注射载体DNA对动脉性ED大鼠无治疗作用。而在VEGF治疗组中，可见到电刺激海绵体神经后，阴茎可发生充血、增粗、增长，但未见明显勃起。海绵体内压与髂内动脉结扎组和注射假质粒组相比明显升高;但与假手术组相比，又有明显差距。表明给予VEGF治疗后，阴茎的侧支循环建立，使勃起功能有所改善，但还没有达到完全恢复的地步。

　　从注射APO实验与电刺激海绵体神经实验的结果上看，可以得出结论，大鼠阴茎海绵体内注射携带VEGF165cDNA的表达质粒后，大鼠阴茎勃起功能有部分恢复，但未达到正常。

参考文献

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