老年患者大肠埃希菌产质粒AmpC酶基因型特点及耐药性分析

　　　　 作者：张淑芳 吴多荣 张应爱 黄会 韩小胜

【摘要】 目的 了解临床分离老年患者大肠埃希菌产质粒AmpC酶的基因型及其耐药(DR)性特点，为临床合理选用抗生素提供依据。方法 收集2009年度老年患者临床不重复分离大肠埃希菌233株，用三维试验和确证试验分别进行羟氨苄青霉素(AmpC)酶和超广谱β内酰胺酶(ESBLs)检测，用接合试验证实酶基因型的转移，通过PCR检测及序列分析进行质粒AmpC酶基因型确定，采用药敏纸片扩散法(KB法)进行药敏试验。结果 233株大肠埃希菌中，头孢西丁抑菌环直径≤17 mm的有53株，占22.7%，酶提取物三维试验检测7株阳性，4株(1.7%)PCR扩增出CMY2型质粒AmpC酶，有1株接合试验阳性;ESBLs阳性占68.7%(160/233)。药敏结果显示产质粒AmpC酶大肠埃希菌对二、三代头孢菌素、氨曲南、头孢西丁和含酶抑制剂的DR率明显高于非产酶株(P&<0.05)，所有大肠埃希菌对亚胺培南和美罗培南均100%敏感。结论 从老年患者中成功分离出产CMY2型质粒AmpC酶大肠埃希菌，产质粒AmpC酶菌株对β内酰胺类抗生素的耐药性明显高于非产酶株。

【关键词】 质粒AmpC酶;大肠埃希菌;基因型;耐药性

　　【Abstract】 Objective To understand the genotype characteristics and drug resistance (DR) in Escherichia coli producing plasmidmediated AmpC βlactamases in the elderly patients so as to guide the rational use of antibiotics in clinical.Methods 233 strains of E.coli isolated from the elderly patients in the 8 hospitals in 2009 were collected.Threedimensional test and certified test were used to detect AmpC and ESBLs;conjugation experiment were used to verify the transitivity of genotype.PCR amplification test and screening analysis were performed to confirm the genotype of plasmidmediated AmpC βlactamases;Disk diffusion susceptibility (KB method) was adopted to detect drug sensitive test.Results Among 233 Escherichia strains，there were 53 Escherichia strains of which Cefoxitin inhibition zone was equal to or below 17 mm (22.7%)，7 positive strains of threedimensional test from the enzymic extraction of which there were 4 strains producing CMY2 type AmpC(1.7%);the drugsensitivity data showed that the resistance to the second and third generation cephalosporins，aztreonam，cefoxitin and containing enzyme inhibitors were significantly higher than those of the no enzymic strains(P&<0.05).All the strains of Escherichia colis were sensitive to meropenem and imipenem.DR rate to 12 antibiotics of these strains producing enzyme (AmpC alone，ESBLs only，both plasmid AmpC and ESBLs) or not had statistically significant differences (P&<0.05).Nonlactamase producing strains remained at a high sensitivity rate to 15 kinds of antibiotics;DR rate of the AmpCproducing strains to the second and third generation cephalosporins，aztreonam and cefoxitin was up to 100%.However，these strains showed a high sensitivity rate to cefepime and carbapenems;ESBLsproducing strains also showed high resistance to the third and fourth generation cephalosporins and aztreonam and other antibiotics，but they were mostly sensitive to carbapenem，enzyme inhibitors and cefoxitin.Both AmpC and ESBLs producing strains increased DR rate to other antibiotics except meropenem and imipenem (sensitive) significantly.Conclusions The resistance of Escherichia coli to βlactam antibiotics mainly includes the production of ESBLs and AmpC，the enzyme production strains can be selected carbapenem on the basis of clinical experience.

　　【Key words】 Escherichia coli;Plasmidmediated AmpC;ESBLs;Drug resistance

　　大肠埃希菌是最常见的医院内感染的细菌之一，其严重耐药(DR)问题已引起临床上的广泛关注，其中产质粒AmpC酶和ESBLs是其DR的主要原因，尤其产质粒AmpC酶的大肠埃希菌耐药性更为严重，它对除第四代头孢菌素和碳青霉烯类之外的所有β内酰胺类抗生素DR〔1〕，此类菌株的流行传播对临床治疗和控制医院感染造成极大困难，目前质粒介导的AmpC酶已经发现了数十种，但国内报道的质粒AmpC酶主要为DHA1、ACT1和CIT1型等〔2〕。为了解我院老年患者临床分离大肠埃希菌产质粒介导AmpC酶的基因型和耐药性情况，现对2009年度从我院老年患者各类标本分离的231株大肠埃希菌进行分析报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 菌株来源、仪器及PCR引物 收集2009年度老年(60～98岁)患者临床标本不重复分离大肠埃希菌株233株，其中：尿102份、痰81份、分泌物16份、血液14份、胆汁10份、脓液5份、其他5份。所有菌株用VITEK32细菌分析仪鉴定到种。质控菌株：阴沟肠杆菌(029M)作为AmpC酶的阳性对照菌株(北京协和医院检验科惠赠);肺炎克雷伯菌(ATCC700603)为ESBLs 阳性对照。药敏质控菌为大肠埃希菌(ATCC25922)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)。VITEK32细菌分析仪及GNI+鉴定卡购自法国梅里埃公司;PCRC1000扩增仪(美国BioRad)，PCR用引物由上海生工生物公司合成。阿莫西林/克拉维酸(AMC)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、亚胺培南(IPM)、美洛培南(MEM)、头孢噻肟(CTX)、头孢他啶(CAZ)、头孢吡肟(FEP)、氨曲南(ATM)、庆大霉素(CN10)、妥布霉素(TOB)、阿米卡星(AK)、头孢西丁(FOX)、左氧氟沙星(LEV)、头孢呋辛(CXM)、MH(MuellreHintn)培养基和肉汤均为英国Oxoid公司产品。

　　1.2 药敏试验 采用CLSI推荐的纸片扩散法(KirbyBauer)进行，根据CLSI2009年颁布的判断标准进行药敏结果判断〔3〕。

　　1.3 ESBLs检测 参照CLSI2009〔1〕推荐的筛选试验和确证试验进行。

　　1.4 AmpC酶检测 ①AmpC酶表型筛选试验：用纸片扩散(KB)法测FOX抑菌环≤17 mm者，提示FOX中介或DR，估测其可能产AmpC酶。②AmpC酶三维试验：参照赵虎等〔4〕报道的三维试验方法(冻融法)进行。阴沟肠杆菌029M为持续高产AmpC酶阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922作为阴性对照。③接合试验参照文献〔5〕进行。④质粒AmpC基因型的鉴定：根据AmpC基因的分群设计多个特异性引物序列，采用PCR扩增法对鉴定菌进行基因型鉴定。⑤PCR引物：分析GenBank数据库收录的质粒AmpC基因序列，将质粒AmpC基因按相似性分为6组，见

参考文献

〔6〕(引物序列见表1)。表1 质粒AmpC基因型检测引物

　　1.5 细菌总DNA提取 采用煮沸法提取细菌总DNA。

　　1.6 PCR扩增 反应体系为25 μl：2×PCR 混合物12.5 μl，上下游引物(10 pmol/L)各1 μl，模板1 μl，用dd h3O补充体积至25 μl，矿物油覆盖，放入C1000扩增仪(美国BioRad)进行扩增。基因扩增条件为：94℃预变性3 min，然后94℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，最后72℃ 充分延伸7 min。

　　1.7 PCR产物鉴定 PCR产物经2%琼脂糖(英国OXIOD公司)凝胶电泳，Go核酸染料染色后，用美国BioRad的凝胶成像系统Gel DXR进行观察并照相、分析。

　　1.8 DNA测序 PCR产物经电泳切胶纯化回收(美国Axygen试剂盒AxyPrepTM DNA Gel Extraction kit)后，送往深圳华大基因研究院测序。测序结果与GeneBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行序列比对分析。

　　1.9 统计学分析 采用世界卫生组织(WHO)提供的WHONET5.4软件进行耐药性统计分析，DR率比较应用SPSS 11.0软件进行χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 产质粒AmpC酶大肠埃希菌的基因型及发生率 233株大肠埃希菌中头孢西丁抑菌环直径≤17 mm的有53株占22.7%。经冻融法提取β内酰胺酶粗提取物进行AmpC酶三维实验有7株为阳性，通过质粒AmpC基因PCR扩增，结果4株扩增阳性，占1.7%(4/233)，经测序和比对确定为CMY2型质粒AmpC酶。电泳图谱见图1。N：阴性对照，1～7：E13，E33，E141，E169，E255，E292，E336，M：DNA MarkerⅠ图1 7株大肠埃希菌质粒AmpC基因PCR产物电泳图谱

　　2.2 接合试验结果 对7株产AmpC酶大肠埃希菌进行质粒接合试验，有1株接合成功，接合子的生化特性与受体菌相同而区别于供体菌，药敏结果与供体菌基本一致，PCR 扩增结果也为CMY2型(见图2)。N：阴性对照，1：E336结合子，M：DNA MarkerⅠ图2 1株结合子的PCR琼脂凝胶电泳图谱

　　2.3 ESBLs的发生率 233株大肠埃希菌中有160株ESBLs检测阳性，占68.7%(160/233)。

　　2.4 产质粒AmpC酶大肠埃希菌的MIC药敏结果 见表2。

　　2.5 药敏试验结果 非产酶、产ESBLs和产质粒AmpC酶的大肠埃希菌对14种抗菌药物的抗菌活性(见表3)。非产酶株与产酶株(产ESBLs株或产质粒AmpC酶株)对12种抗生素DR率差异显著(P&<0.05)。非产酶株对14种抗菌药物均显示较高的敏感率;产质粒AmpC酶菌株对二、三代头孢菌素、氨曲南和头孢西丁的DR率达100%，但对头孢吡肟和碳青霉烯类却显示较高的敏感率;产ESBLs菌株对头孢噻肟等多种抗生素表现出较高的耐药性，但对碳青霉烯类、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星和头孢西丁等抗菌药物多为敏感。表2 4株产质粒AmpC酶大肠埃希菌对14种抗菌药物的MIC结果表3 大肠埃希菌(总)、非产酶株、产ESBLs株和产质粒AmpC酶株对14种抗菌药物的体外抗菌活性

　　3 讨 论

　　自2002年陈轶兰等〔7〕首次发现北京协和医院1株临床分离大肠埃希菌产ACT1型质粒AmpC酶以来，近年来国内对质粒AmpC酶基因型的研究报道已逐年增多，主要以DHA1型和ACT1型多见。产质粒AmpC酶大肠埃希菌具有广泛的耐药性，其DR谱大于ESBLs，不仅对一、二、三代头孢菌素及氨曲南DR，而且也对头霉菌素类和酶抑制剂类DR，有报道AmpC酶合并膜孔道蛋白OmpF和OmpC丢失可造成对碳青霉烯类药物DR〔8，9〕。本研究通过三维试验和PCR方法对老年患者临床分离233株大肠埃希菌产质粒介导AmpC酶进行基因检测和序列分析。 CMY2型质粒AmpC酶是流行和分布最为广泛的质粒AmpC酶，在多个国家均有发现，有报道〔10〕它能在不同菌属的细菌中流行和传播，而且能引起爆发流行〔11〕，目前国内CMY2型质粒AmpC酶只有上海蒋燕群等〔12〕报道。

　　从药敏结果显示，分离自老年患者体内的大肠埃希菌产质粒AmpC酶菌株占1.7%，产ESBLs菌株占68.7%，非产酶株与产酶株(产ESBLs株或产质粒AmpC酶株)对12种抗生素DR率差异显著(P&<0.05)。非产酶株对14种抗菌药物均显示较高的敏感率;产质粒AmpC酶菌株对二、三代头孢菌素、ATM和FOX的DR率达100%，但对FEP和碳青霉烯类却显示较高的敏感率;产ESBLs菌株对CTX等多种抗生素表现出较高的耐药性，但对碳青霉烯类、TZP、AK和FOX等抗菌药物多为敏感。由于IPM等碳青霉烯类抗生素具有抗菌谱广、抗菌活性强、对β内酰胺酶高度稳定和毒性较低等特点〔13〕，因此已作为产质粒AmpC酶或产ESBLs菌株所致严重感染的首选药而被广泛应用，但目前已有报道从老年患者中分离出对IPM的DR的大肠埃希菌〔14〕。从本研究可见，分离自老年患者体内的大肠埃希菌已见有产CMY2型质粒AmpC酶菌株流行传播，特别是产ESBLs菌株更为突出，这些菌株的耐药性相对较高，给临床治疗带来很大的困难，应当引起临床医师的高度重视。

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