作者：杨征 黄燮南 邱敏 吴芹
【摘要】 目的：制备生物活性良好的家兔离体动脉条。方法：以传统的家兔离体动脉条的制备方法为基础，从动物选择、保养液的配置、血管取材、动脉条制备等多个重要环节进行摸索，成功建立了家兔离体动脉条的模型；用家兔主动脉等张收缩的方法，观察去甲肾上腺素（NA）、5-羟色胺（5-HT）和高钾所致离体动脉条收缩反应的影响；应用无Ca2+-复Ca2+的实验方法，以NA作为血管收缩剂，间接观察对细胞内游离钙浓度（[Ca2+]i）的影响。结果：与传统家兔离体动脉条的制备方法相比，改良后NA 10 nmol/L～300 μmol/L、5-HT 10 nmol/L～10 μmol/L、KCl 10～100 mmol/L可致动脉条呈浓度依赖性收缩直至出现最大收缩效应；在无钙Krebs液中，NA 1 μmol/L可致动脉条呈短暂收缩，复钙后等量NA可诱发持续收缩。结论：此方法能使动脉条活性更佳，可作为研究高血压病、抗高血压药物及其相关信号转导通路的有效模型。
【关键词】 动脉条；兔；细胞内游离钙浓度；去甲肾上腺素
Abstract Objective: To prepare thoracic aorta strips of the good bioactivity with rabbits in vitro. Methods: The traditional method was applied by improving several key processes such as selection of animal， preparation of Kreb's and aorta strips， and consequently the thoracic aorta strips model of rabbits was successfully established in vitro. The isotonic contraction of the thoracic aorta strips of rabbit was recorded to observe the effects on the concentration-response curves for noradrenaline(NA)， 5-hydroxytryptamine(5-HT) and high potassium. The procedure of Ca2+ free- Ca2+ addition was designed to observe indirectly the effects on intracellular free Ca2+ ([ Ca2+]i) by NA. Results: Compared with the traditional method，NA 10 nmol/L-300 μmol/L，5-HT 10 nmol/L-10 μmol/L， KCl 10 -100 mmol/L could induced contraction with a concentraction-dependent manner and the maxium response. NA could induce transient contraction in Ca2+- free medium and the long-lasting by addition of Ca2+ after improving the method. Conclusion: It provides a good model for the study of mechanism and signal transduction pathway of Hypertension and antihypertensive drugs.
Key words Aortic strips； Rabbit； Intracellular free calcium； Noradrenaline
高血压病是全世界举世瞩目的流行病，据统计我国现有高血压病患者超过1亿人，并有继续上升的趋势。众所周知，血管对血压的形成和维持具有重要作用，动脉血压过高多半是由于平滑肌过分收缩，引起外周阻力增高所致，因此动脉血管平滑肌是研究高血压病发病机制和防治工作的重要对象[1-2]。离体动脉条的制备是上述研究工作必不可少的环节，但如何制备血管生物活性良好的离体动脉条是研究工作的前提。以传统的家兔离体动脉条的制备为基础，研究动物选择、保养液的配置、血管取材、动脉条制备等因素改良后血管生物活性的改变，是最终阐明上述血管疾病发病机制的良好体外研究的关键。本实验在参照传统经验的基础上，结合自己的经验，摸索出了一种新的离体动脉条制备的方法。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
重酒石酸去甲肾上腺素（NA）、5-羟色胺（5-HT）购自美国Sigma公司；咖啡因由上海三联医药技术服务部分装；NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、NaHCO3、葡萄糖系重庆北碚化学试剂厂出品的分析纯试剂。正常Krebs保养液的组成：NaCl 120.0 mol/L，CaCl2 2.2 mol/L，KCl 5.4 mol/L，MgCl2 1.0 mol/L，NaHCO3 25.0 mol/L，葡萄糖 5.6 mol/L，溶液pH 7.4。无钙Krebs保养液的组成：不含CaCl2，并加入EGTA 0.5 mmol/L，其它同正常Krebs保养液。
XWTD-204，台式自动平衡记录仪，张力换能器（上海大华仪表厂）。
1.2 方法
1.2.1 动脉条的准备
健康家兔（遵义医学院实验动物中心提供）体重1.5±0.5 kg，雌雄兼用。将兔用木锤击昏并颈动脉放血后，迅速取出胸主动脉，剥离干净周围结缔组织并用眼科弯镊钝性刮除内皮，剪成约20 mm×2.5 mm的螺旋条，置于含有Krebs营养液20 mL的恒温（37 ℃）水浴槽中，持续通入95 % O2+5 % CO2混合气体，pH 7.3～7.4，静息负荷2 g，每隔15 min更换营养液1次，平衡90 min后加入激动剂。血管的收缩力经张力换能器连接于XWTD-204台式自动平衡记录仪记录之。实验中所需药物浓度均按最终浴槽浓度计算。
1.2.2 NA、5-HT和高钾动脉条收缩反应实验
在浴槽内加入NA、5-HT 1 μmol/L和KCl 50 mmol/L，待动脉条收缩至坪值后冲洗，平衡1 h后以同法加入同量的NA、5-HT和KCl，重复数次至收缩高度前后两次基本不变，视为动脉条的收缩已达稳定。平衡1 h后在浴槽按0.5及0.2对数递增加入NA、5-HT和KCl，直至出现最大收缩效应[3-4]。
1.2.3 无Ca2+-复Ca2+实验
判断动脉条收缩反应稳定性的方法同NA量效曲线实验，平衡1 h，用无Ca2+ Krebs液冲洗，稳定3 min，再加入NA 1 μmol/L可致动脉条呈短暂收缩。待其舒张平稳后累积加入Ca2+ 1.1mmol/L、2.2 mmol/L可见随Ca2+浓度增加，动脉条再次收缩并出现峰值[5-6]。
2 结果
2.1 NA、5-HT和高钾诱发的动脉条收缩反应
向浴槽内按0.5对数递增加入NA 10 nmol/L～300 μmol/L、5-HT 10 nmol/L～10 μmol/L以及按0.2对数递增加入KCl 10～100 mmol/L，动脉条出现浓度依赖性收缩，直至最大收缩效应。通过记录血管收缩曲线可见，改良后制备动脉条的活性优于传统方法。见图1、图2。
2.2 NA在无Ca2+液中及复Ca2+后的缩血管效应
在无钙Krebs液中，两种方法NA 1 μmol/L均可诱发动脉条短暂收缩，复Ca2+后（Ca2+1.1 mmol/L和2.2 mmol/L）等量NA可致动脉条持续收缩，但传统方法较改良方法制备的血管活性稍差。见图3。
3 讨论
鉴于高血压病发病率、病死率呈逐年上升趋势，动脉平滑肌细胞的收缩、舒张与高血压等多种心血管疾病的病变过程相关[7]，为研究高血压病发病机制、抗高血压药物及其相关信号转导通路，需要提供一种稳定的实验模型，而离体动脉条为其提供了一种重要的实验方法。下面将实验中的一些体会、需注意的问题以及实验中改进的方法总结如下：（1）动物的年龄和体重：传统方法常规选用体重在2.1～2.3 kg家兔，本实验选用家兔体重为1.5±0.5 kg。结果显示，年幼并且体重较轻的家兔动脉条生物活性更好，提示年幼且体总重轻的家兔更易获得良好的血管条活性。（2）取材：在保证血管活性良好的情况下取材的速度应尽可能快，一般在5 min左右；为使血管活性良好，在取材过程中应避免牵拉。（3）动脉条标本的制备：传统方法的动脉条一般为20 mm×2 mm，动脉条一般约20 mm×2.5 mm，但我们在实验中发现血管条的长度并不是影响其收缩的主要因素，而影响其收缩主要是动脉条的宽度，故在规定范围内制备标本时应尽量宽一些，本实验中选用的血管条约为20 mm×2.5～3 mm，并且应尽量保持其边缘整齐、光滑。如果动脉条边缘过度受损或毛糙不平会影响血管收缩；在剪条的过程中最好不要剪成长方形，而应剪成菱形，以方便拴线。在制备动脉条过程中，应先向放置动脉条的Krebs液中充入95 % O2+5 % CO2混合气体，确保动脉条生物活性良好。（4）动脉条标本的贮存：动脉条置于Krebs液中4 ℃冰箱放置过夜，血管收缩活性更佳，其机制还有待于进一步研究。（5）动脉条标本的悬挂：剪成菱形的动脉条两端尖的部分拴线，拴线应尽可能靠两端，以确保动脉条平整而不皱摺，否则影响其收缩活性。固定于传感器一端的动脉条应与L型环保持垂直并且线应固定于传感器孔中央，使其受力均匀；如果悬挂倾斜，使动脉条受力不均匀影响其收缩。（6）保养液的配制：与传统的Krebs保养液配制不同，本实验中Krebs保养液中的Krebs保养液需用新鲜三蒸水按照常规Krebs液配制方法配制，但是CaCl2和MgCl2需单独配制并分装，临用时最后加入，而葡萄糖最好现用现配后再加入。这是因为CaCl2过早加入无钙Krebs保养液中易形成碳酸钙沉淀，MgCl2过早加入使保养液MgCl2中结晶水容易挥发，导致保养液中的Ca2+、Mg2+含量下降，而葡萄糖过早加入则代谢为h3O和CO2，使血管条不能够获得充足的能量。（7）实验操作：与传统方法不同，我们认为换液不宜频繁，一般15 min左右一次，因为按照常规Krebs保养液配制表配制的Krebs液呈碱性，pH值一般都在8左右，碱性的保养液对动脉血管平滑肌细胞有损伤作用。另外，传统方法认为在更换保养液时应衡量缓给混合气，但我们要特别强调，每次新换保养液时早期应开大加快混合气体（95 % O2+5 % CO2）输入，让通入的CO2气体缓冲，使pH值尽可能迅速下降而达到正常，从而保持血管条良好活性。而缓冲后则应当把混合气体关小，因为如果混合气体一直持续很大，长时间的大流量的氧气不仅可以使血管条频繁进行气体交换，容易产生疲劳，而且还可以使Krebs液环境偏酸，都能够影响动脉条收缩。Krebs保养液的温度应尽量保持在37 ℃左右。两次刺激间隔时间要保证在1 h左右，以使动脉条充分休息回到静息水平。最后，加入激动剂时应使用长针头并将针头伸向浴槽底部，最好是在通入的气体附近，并且给药速度要快，这样由于通入气体的搅拌作用有利于药物迅速混匀使动脉条受力均衡。
本文所介绍的制备离体动脉条方法具有良好的生物活性，可为高血压病、抗高血压药物以及相关信号转导通路的研究提供一个理想的实验平台。
参考文献
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