【摘要】 目的：探讨力竭运动后大鼠心肌肌钙蛋白-T（cTnT）分布及含量的变化。方法：将50只健康成年雄性SD大鼠随机分为一次力竭运动组和安静对照组，运动组采用游泳运动方式分别于力竭运动后即刻、6 h、12 h、24 h取材，应用免疫荧光技术和图像分析方法对大鼠心肌肌钙蛋白-T分布及含量的改变进行研究。结果：力竭运动后各时相大鼠心肌cTnT分布变得紊乱，在心肌细胞间及细胞内的分布不均一；一次力竭后即刻、6 h和12 h右心室cTnT含量高于对照组（P＜0.01）。结论：一次力竭运动均可使心肌cTnT分布变得紊乱，这可能是导致心肌机械功能异常的原因之一。
【关键词】 力竭运动；心肌微损伤；肌钙蛋白T
Abstract Objective: To observe the changes in the distribution and the content of troponin T(cTnT) in myocardial tissue of cats after exhaustion exercise at different time points. Methods: Fifty Male Sprague-Dawley rats were randomly pided into sedentary control group and single bout of exhaustion exercise groups. Rats in the exhaustion exercise group were killed for the specimen of cTnT 0 h，6 h，12 h and 24 h after exhaustion exercise. Immunofluorescence technique and image-analysis were used to study the changes in distribution and content of cardiac troponin T(cTnT) in myocardial tissue of the rats. Results: After single bout of exhaustion exercise， myocardial cTnT distribution became disuniform， in which myocardial cTnT became increased， decreased or even vanished in different sections. Right ventricle myocardial cTnT content 0 h，6 h and 12 h after single bout of exhaustion exercise was remarkable higher than that in the control group (P&<0.01). Conclusion: Single bout of exhaustion exercise may cause disorder and disuniformity in the distribution of myocardial cTnT， which may be one of the reasons for myocardial mechanical malfunction.
Key words Exhausive exercise； Heart micro-injury； Cardiac troponin T
研究发现，反复持续进行的大强度运动和急性力竭运动可对机体产生不利影响，常导致运动性疲劳与损伤的发生，尤其是运动性心肌微损伤[1-3]，可直接影响执行心肌特殊功能的蛋白质的表达异常，造成心肌功能的异常。心肌肌钙蛋白（cTn）是存在于心肌肌原纤维中细肌丝上的收缩调节蛋白，主要调节心肌收缩过程中粗、细肌丝之间的相对滑行。cTn分子呈球形，含3个亚单位，即cTnC、cTnI和cTnT。cTnT的作用是将整个肌钙蛋白分子结合于原肌凝蛋白。当心肌细胞受损时，cTn可从细胞中释放至血液循环中，现有方法可从外周血清中检测cTnT和cTnI。目前临床上把cTnT认为是确定心肌发生心肌缺血、缺氧最早的标志物。有学者采用大鼠的心肌缺血模型，利用免疫组化的方法测量缺血后不同时间段的cTnT改变情况，发现大鼠急性心肌缺血15 min cTnT即出现明显缺失，随着缺血时间的延长，cTnT的缺失面积逐步增大[4]，籍此认为cTnT对于早期心肌缺血损伤的病理学诊断是一个敏感的指标，同时也说明缺血、缺氧可以造成心肌cTnT的降解。肌钙蛋白作为介导肌丝滑动的结构物质对心肌正常机械功能的发挥有重要作用，肌钙蛋白的降解可能是造成心肌机械功能障碍的原因之一。关于力竭运动后cTnT改变的实验研究尚未见报道，本研究选择cTnT作为目标因子，旨在研究不同力竭运动后心肌cTnT的改变，为运动性心肌微损伤时心肌纤维病理改变和心肌机械功能异常发生机制的探讨提供实验依据。
本研究制定了力竭游泳运动实验动物模型，观察实验大鼠在力竭运动后即刻、6 h、12 h和24 h 4个时相点cTnT分布及含量的变化，试图为力竭运动后心肌机械功能异常的发生机制探讨提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组
健康雄性成年SD大鼠50只，体重（260±8 ） g。大鼠随机分为5组，每组10只，其中一次力竭游泳运动4个组，对照1个组，各组间大鼠初始体重差异无显著性（P＞0.05）。国家标准啮齿动物饲料喂养，自由饮食。饲养环境为室温（20±2) ℃，光照时间12 h，相对湿度40 %～55 %。
1.2 实验方法
1.2.1 力竭游泳运动
采用PVC特制泳池，规格为1.6 m×0.8 m×1.2 m，内壁光滑，水深约60 cm，超过大鼠身长2倍，控制水温在30～33 ℃。运动组大鼠进入动物房后首先适应3 d，然后进行2 d适应性游泳运动（20 min/次），每次运动后，迅速用干毛巾擦干大鼠体表水分，电吹风吹干后，放回笼中休息，第3 d尾部负重3 %体重的重物进行一次力竭运动，力竭标准参照Thomas的报道[5]。对照组笼中饲养，无运动干预。
1.2.2 大鼠心肌取材
一次力竭运动组分别于运动后即刻、6 h、12 h、24 h取材，对照组正常饲养相应天数后与运动组同时取材。大鼠腹腔注射10 %水合氯醛（1 mL/100 g体重）麻醉后，开胸并迅速取出心脏，经灭菌生理盐水清洗后迅速垂直于心脏长轴切取心肌组织，滴加OCT包埋剂后置于液氮冷冻20 s后转入冰冻切片机恒温箱，切取7 μｍ厚的冰冻切片，置于-70 ℃超低温冰箱备用。
1.2.3 心肌冰冻切片的免疫荧光染色
cTnT在胞浆内表达，采用绿色荧光标记，具体步骤如下：（1）将-70 ℃超低温冰箱保存的冰冻切片取出，室温复温30 min后入4 ℃丙酮固定10 min，PBS漂洗5 min×3次；（2）10 %正常山羊血清封闭，室温孵育10 min；（3）弃去血清，勿洗，滴加1∶100稀释的小鼠抗大鼠cTnT（美国Lab Vision公司），4 ℃过夜，PBS漂洗5 min×3次；（4）滴加1∶100稀释的FITC标记兔抗小鼠IgG，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗5 min×3次；（5）60 %的缓冲甘油封片。
1.2.4 免疫荧光图像的采集和分析
使用Leica AS MDW多维成像工作站采集免疫荧光图像，所有图像均以同一曝光时间及相同条件采集。每张切片左、右心室各随机选取心肌纵切视野5个，将数字化图像储存于计算机。应用JD801形态学图像分析系统进行图像分析，测定结蛋白的积分光密度（intergrated optical density，IOD)，以IOD的大小代表结蛋白量的多少，对其进行定量分析。
1.2.5 统计学处理
所有数据均用SPSS12.0软件包进行统计分析。组间进行单因素方差分析，结果均以均数±标准差表示，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠心肌cTnT免疫荧光图像
图1为正常心肌纵切的cTnT免疫荧光图像，绿色点状或块状荧光斑是cTnT，可见正常对照组心肌cTnT均匀分布于心肌细胞内，使心肌纤维横纹清晰可见。图2为一次力竭组的cTnT免疫荧光图像，可见部分心肌细胞cTnT荧光斑有荧光增强的现象，而有些心肌细胞有荧光减弱甚至缺失的现象，cTnT在心肌的分布变得紊乱，心肌纤维横纹变得模糊。左、右心室cTnT免疫荧光图像改变一致。
2.2 大鼠cTnT的免疫荧光图像分析
一次力竭运动后各时相组左心室cTnT含量与对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05），一次力竭运动后各时相左心室cTnT含量呈先上升后下降的趋势，各时相之间差异也无统计学意义（P＞0.05）。一次力竭运动后即刻组、6 h组和12 h组右心室cTnT含量高于对照组（P＜0.01），一次力竭运动后各时相右心室cTnT含量呈先上升后下降的趋势，但运动后各时相之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。表1 一次力竭运动后各时相大鼠左、右心室cTnT IOD值（略）
3 讨论
cTnT是存在于心肌肌原纤维中细肌丝上的收缩调节蛋白，主要调节心肌收缩过程中粗、细肌丝之间的相对滑行，cTnT的作用是将整个肌钙蛋白分子结合于原肌凝蛋白。cTnT在心肌细胞内以两种形式存在，一是作为cTnT的前体成分游离存在于胞浆内，二是以与原肌球蛋白结合的形式存在于肌纤维中，前者约占总量的5 %，后者占95 %。当力竭运动造成心肌细胞损伤时，细胞膜的完整性遭到破坏，游离的cTnT首先释放入血液中，血清cTnT少量短暂升高，如损伤继续加重，结合部分的cTnT继而从肌纤维上降解下来，导致血清cTnT成倍的持续性升高，这已在同步的血清研究中得到证实。由于细胞内的cTnT流失到细胞外，致使细胞内的cTnT的含量应有所下降，但是从本次试验的结果来看，并没有出现这样的情况。
一次力竭运动后即刻、6 h和12 h，右心室cTnT含量明显高于对照组，运动后即刻最高，从即刻开始直到运动后24 h逐渐下降；一次力竭运动后左心室各时相cTnT与右心室一致，也是呈先升高后下降的趋势，但各时相之间以及各时相与对照组之间差异无统计学意义。本实验所出现的结果有可能是由于运动使得cTnT基因的表达在短时间内（运动所持续的时间内）明显升高，并且新产生的cTnT量远远大于经细胞膜漏出的量，所以在运动后即刻右心室cTnT含量明显高于对照组；亦有可能是力竭运动使得cTnT成为游离状态，暴露了更多的抗原结合位点，造成cTnT含量增多的假象；至于其后的下降可能是由于缺血后的再灌注损伤使细胞膜的完整性极大的破坏，cTnT经细胞膜进入血液，而此时基因的表达又可能有显著的下降，所以在运动后24 h，cTnT含量有所降低。
力竭运动除了造成cTnT量的变化之外，还造成了细胞内cTnT分布的变化。由于力竭运动造成心肌细胞膜的损伤，而且细胞膜的损伤在不同的细胞或细胞的不同部位有所差异，造成cTnT的漏出在不同细胞以及同一细胞的不同部位有所差异，同时力竭运动后cTnT基因表达的量的增高在不同细胞也可能出现差异。还有一种可能就是力竭运动使与心肌肌原纤维结合的cTnT从肌原纤维上游离下来，并在胞浆内聚集；3种因素综合作用导致了cTnT在细胞内分布的变化，表现在免疫荧光图像上为荧光斑分布不均匀，有的部位增强，有的部位减弱或缺失。综上所述，力竭运动造成的心肌细胞膜损伤和运动本身所致cTnT基因表达增强是cTnT分布和含量改变的机制。
邓大中等[4]采用大鼠的心肌缺血模型，利用免疫组化的方法测量缺血后不同时间段的cTnT脱失情况。大鼠急性心肌缺血15 min时cTnT即出现明显缺失，随着缺血时间的延长，cTnT的缺失面积逐步增大，反映了cTnT对于早期心肌缺血损伤的病理学诊断是一个敏感的指标。在血清cTnT含量与静息时心功能关系的研究中发现，血清cTnT含量与左心室节段运动异常数目存在正相关性，与射血分数之间存在负相关性，因此cTnT可以作为评价心功能的参考指标[6]，同时也提示cTnT降解可能是心肌缺血损伤时心肌机械功能异常的原因之一。
本研究结果显示，尽管力竭运动后cTnT含量没有明显下降，但各时相cTnT的免疫荧光图像改变反映出力竭运动后cTnT的分布发生了改变，即不同心肌细胞以及同一心肌细胞的不同部位的cTnT分布不均，相对于对照组的均匀分布发生了变化。这种变化可能反映整个肌钙蛋白分子的变化，而肌钙蛋白分子的这种变化可能使不同部位心肌以及不同心肌细胞的收缩力出现差异，致使心肌原有的机械功能发生变化，整个心脏的机械功能出现障碍。
参考文献
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[3] Anversa P，Levichy V，Beghi C，et al.Morphometry of exercise induced right ventricular hypertrophy in the rat[J].Cir Res，1983，52:57-64.
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