【关键词】 高效液相色谱 电感耦合等离子质谱 硒 化学种态
硒（Selenium，Se）是人体的必需微量营养元素，环境和生物体内的硒主要以中性和离子形态的无机和有机硒化合物、硒代氨基酸和各种硒蛋白的形式存在。对于不同化学形态硒的代谢、吸收、生物利用率及转化过程的研究，已成为生命科学、医学、环境科学等相关领域关注的热点。特别是各种高效的分离手段同高灵敏度的检测方法相结合的联用分析技术的快速发展，使对硒的化学种态研究不断深入。本文主要综述高效液相色谱-电感耦合等离子质谱（HPLC-ICP-MS）在线联用技术在硒化学种态分析中的进展。
1 硒的化学种态分析
饮食中过量的硒会对机体造成毒性反应，这就要求我们对硒的不同化学形态和氧化态进行准确和精确的检测。硒的化学种态分析除弄清元素价态外，还要区分有机态硒和无机态硒、离子态硒和非离子态硒，以及与肽或蛋白的结合或螯合等不同硒的化学种态结构信息，这就需使各种硒的化合物在分析前实现时间和空间上的完全分离。硒的化学形态的分析也常常需要两种技术联用：一种是硒的化学形态分离的技术，另一种是具有高灵敏度的检测方法[1]。用于硒的化学种态分析的联用技术既可以是非在线（off-line）联用分析，如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与柱前衍生高效液相色谱分离荧光检测、放射自显影、中子活化分析(NAA)、氢化物原子荧光法(HG-AFS)、同步辐射X-射线荧光(SRXRF)联用[2]。也可以是在线（on-line）的，如色谱或毛细管电泳技术与灵敏度较高的电感耦合等离子质谱技术（ICP-MS）的在线联用都被证明是最有效硒的化学种态分析的联用体系[3]。
2 ICP-MS与硒的化学种态分析
电感耦合等离子质谱法（ICP-MS）与传统的检测器相比，ICP-MS在硒元素的化学种态分析中具有很多优点，如在硒元素分析时具有较高的敏感性、宽的动态线性范围、对元素具有较低的检测线（ng/L）以及具有多元素分析与同位素比率测定的功能[4]，另外，ICP-MS的谱线简单，检测模式灵活多样，既可以通过元素谱线的质荷之比（m/z）进行定性分析，又可以通过谱线全扫描测定所有元素的大致浓度范围，即半定量分析，更重要的是可以用标准溶液校正而进行元素的定量分析，这种方法在硒的化学种态分析中得到了最为广泛的应用。
3 HPLC与ICP-MS连接
高效液相色谱技术适合于非挥发性硒的化学种态分析，样品在分析前不需要衍生，但分离的液体样本在引入等离子体之前需要经过雾化器雾化之后再引入等离子体，因此，必须有雾化器与ICP-MS相连。气动雾化器和同心雾化系统是HPLC常用的接口，它们很容易实现HPLC与ICP-MS的在线连接。超声雾化器和直接注射雾化器也可以应用于低流速的HPLC。Zheng等[5]曾应用超声雾化器作为HPLC与ICP-MS的接口用于硒的化学种态分析。直接注入雾化器可以将样品直接传输到等离子体焰炬而不需进入雾化室，虽然直接注入雾化器在毛细管电泳与ICP-MS的接口中经常被用到，但在应用HPLC对硒的化学种态分析中也有阐述[6]。目前，HPLC和ICP-MS的接口通常采用聚四氟乙烯(PTEE)管或不锈钢管直接导入ICP的雾化器。
4 用于硒的化学形态分离的HPLC
环境和生物体内的硒化物大多都具有非挥发性，高效液相色谱技术由于适合于非挥发性硒的化学种态分析成为文献中报道最多的用于硒化物分离的技术。由于样本不需要衍生，避免了采用气相色谱法分离时衍生过程中加热引起的化合物的分解。另外，与毛细管电泳相比，HPLC在分离硒化物时具有很好的重现性。HPLC用ICP-MS作为检测技术采用碰撞池技术对硒元素具有很好的检出线，Encinar等[7]采用碰撞池技术对人的血清中硒元素进行检测，检出线低于0.5μg/kg。由于HPLC与ICP-MS很容易进行接口连接，而且可达到较低的检测线，使ICP-MS成功地应用于元素的分析。很多HPLC分离模式与ICP-MS在线联用被应用于硒的化学种态分析，包括离子交换色谱、反向离子对色谱、排阻色谱及手性色谱等。
4.1 反向离子对色谱法(Reversed-phaseion-pair HPLC) 反向离子对色谱(Reversed-phaseion-pair chromatography)属于反向色谱的一种改进形式，这种色谱方法能同时分离阴离子、阳离子和中性化合物。含有4个碳原子以上的烷基磺酸盐常被作为离子对试剂，曾被用来分离三甲基硒离子、硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸。三氟乙酸(TFA)作为离子对试剂(0.1%TFA，98︰2水-甲醇)也是很好地通用分析体系，有较好的分辨率和合适的保留时间。五氟丙酸(PFPA)和七氟丁酸(HFBA)可使物质分辨率提高。特别是以0.1%的七氟丁酸作为反向离子对试剂更能提高对有机硒化物的分辨率。Kotrebai等[8]用0.1%的七氟丁酸（HFBA）作为反向离子对试剂分析了含20种硒化合物的混合标准，结果对多种化合物均有较好的分离效果。喻宏伟等[9]采用0.1%的七氟丁酸（HFBA）作为反向离子对试剂分离了人肝脏胞质溶胶中的亚硒酸、硒酸、三甲基硒、硒代半胱氨酸和硒代尿素以及人尿样中的亚硒酸、三甲基硒、硒代甲硫氨酸、硒代半胱氨酸和硒代尿素。
4.2 离子交换色谱法(Ion-Exchange HPLC) 离子交换色谱（Ion-Exchange chromatography ）主要用来分离样品中带有电荷的化合物。分离过程主要基于带电溶质离子与固定相表面具有反电荷离子的交换平衡。溶质离子和流动相中等电荷离子竞争固定相上反离子，这种竞争决定了分析物离子的相对保留时间。根据各种物质在离子交换柱中的保留时间的不同从而将它们分开。Huerta等[10]用阴离子交换色谱分离了富硒酵母中的硒代甲硫氨酸、硒酸盐和亚硒酸盐，在流动相柠檬酸铵中加入2%的甲醇可增强ICP-MS检测信号。Lsrsen等[11]用阳离子交换柱、用含3%甲醇的吡啶甲酸盐为流动相采用梯度洗脱方式（洗脱液的浓度从0.75～8.00mmol/L），成功分离了10种标准有机硒化物和富硒酵母酶解液样本中的30种硒化物。
4.3 排阻色谱法（Size-exclusion HPLC） 排阻色谱（size exclusion chromatography，SEC）常用来分离样品中的蛋白质和多肽等一些生物大分子，进入色谱柱的被分析物依照分子量大小得到分离。在硒的化学种态研究中，排阻色谱经常被用来分离来自样本基质中的硒蛋白，由于排阻色谱分离的理论塔板数太小，分辨力太差，当用ICP-MS做检测器时排阻色谱不能将分子量相近的硒化合物很好的分离开来。因此，在分离硒蛋白时常与其他色谱模式共同来完成。先用排阻色谱法使被分析物依照分子量大小得到分离，然后用亲和色谱和离子交换色谱可进一步分离具有相似分子量的硒蛋白。Mounicou等[12]利用二维色谱分离方法分析印度富硒芥菜中的含硒蛋白，先用Superdex 75排阻色谱柱分离富硒芥菜中不同分子量大小的含硒蛋白，然后用Mono-Q 5/50 GL强离子交换快速蛋白柱将这些硒蛋白再进一步分离。
5 HPLC-ICP-MS联用技术展望
近年来，应用于硒的化学种态研究的联用技术越来越多，HPLC-ICP-MS在线联用不但具有最高的敏感性，同时也可获得最低的检测线。ICP-MS的一个重要进展是用动态反应池(DRC)和碰撞池(CCT)技术来检测 80Se，这在硒的化学种态研究中也有应用。作为分离技术，HPLC可以提供多种分离模式，这也会促进该技术在硒的化学种态研究领域中的广泛应用。
参考文献
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