作者：关泽红 刘旭东 刘淑萍 云志厚 孟化 张建宇 姜彩虹
【摘要】 目的：探讨癌基因C-K-ras和抑癌基因Rb点突变与胰腺癌发生的关系。方法：选择经病理学证实的原发性胰腺癌19例、胰腺癌恶性淋巴瘤1例、胰腺多形细胞癌2例和慢性胰腺炎5例的石蜡包埋组织样本，采用PCR-SSP法检测C-K-ras 12位密码子和Rb第21位外显子的点突变情况。结果：19例原发性胰腺癌石蜡包埋块样本中有7例C-K-ras 12密码子发生了点突变，占36.8%，其中1例为两种突变形式（GAT、GTT）；有9例Rb第21位外显子发生了点突变，占47.3%；而在胰腺癌恶性淋巴瘤、胰腺多形细胞癌和慢性胰腺炎样本中均未检出上述突变情况。结论：C-K-ras 12位密码子和Rb第21外显子点突变与胰腺癌的发生有一定的相关性。
【关键词】 胰腺癌；癌基因C-K-ras；抑癌基因Rb；点突变
Abstract Objectives: To study the correspondence of point mutation of oncogene C-K-ras and antioncogene Rbwith the occurrence of pancreatic carcinomas. Methods: The point mutation of C-K-ras at 12 codon and Rb at 21thexon were detected by PCR-SSP in the araffin embedding samples of 19 cases of pancreatic carcinomas ，1 case ofpancreatic lymphoma ， 2 cases of pancreatic polymorphous cell carcinomas and 5 cases of cronic pancreatitis.Results: C-K-ras mutation at 12 codon were detected in 7 cases of the 19 pancreatic carcinoma samples (37%)， oneof which displayed two kinds of mutation (GAT and GTT); Of 19 cases of pancreatic carcinomas，9 cases were detectedwith mutation of Rb 21th exon (47.4%); No mutation in C-K-ras 12th codon and Rb 12 exon were detected in cronicpancreatitis，pancreatic lymphoma and pancreatic polymorphous cell carcinomas samples. Conclusion: There is somecorrespondence of point mutation of oncogene C-K-ras and antioncogene Rb with the occurrence of pancreaticcarcinomas.
Key words Pancreatic carcinomas;Antioncogene; Rb; Oncogene; C-K-ras ; Point mutation
胰腺癌(Pancreatic Carcinoma)是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一。它的发病率在西方国家的过去30年间增加了3倍[1]，中国增长了6倍[2]。由于其发病隐匿，尚缺早期诊断手段，一经确诊常常已到晚期，错过了最佳治疗时期，致使预后极差，五年生存率不足2%。随着分子医学与分子生物学的发展及许多新技术新方法的应用，逐步揭示了许多疾病的发生与基因突变或表达异常有关。目前比较一致的看法认为，肿瘤的发生是由于细胞生长调控机制紊乱造成的。正常细胞的增殖分化是由两大类基因调控的，一类是正调控信号，促进细胞的生长和增殖，并且阻止其向终末分化，现知多数癌基因起这一作用；另一类是负调控信号，促进细胞成熟，向终末分化，最后凋亡，现知抑制癌基因可能发挥这方面的作用。正常情况下，这两种信号保持动态平衡，对细胞生长、增殖和凋亡进行精确的调控。一旦两者之间平衡被破坏，如癌基因激活或抑癌基因失活，必将导致细胞增殖紊乱而发生癌变。近年来的研究表明，癌基因或抑癌基因突变是细胞癌变的关键性因素，可望成为癌症早期诊断的重要指标。本文通过检测胰腺癌组织中癌基因C-K-ras和抑癌基因Rb的点突变情况，研究胰腺癌发生的分子机理，分析癌基因C-K-ras和抑癌基因Rb的点突变作为胰腺癌早期诊断的可能性。
1 材料与方法
1.1 材料
45例标本来自呼和浩特地区内蒙古医学院和内蒙古医院病理科，所有标本均经10%福尔马林固定、石蜡包埋，病理组织学证实为胰腺癌，其中胰腺癌37例，胰腺恶性淋巴瘤1例，胰腺多形细胞癌2例，慢性胰腺炎5例。
1.2 主要仪器试剂
台式高速离心机，TGL，上海制造；水平式电泳槽，DYY-Ⅲ31B，北京制造；微电脑DNA扩增仪，1109型，北京制造；PCR试剂盒和标准DNA Marker，华美生物工程公司北京分公司；Rb基因PCR引物由上海生物工程有限公司合成；C-K-ras基因PCR引物由华美生物工程公司北京分公司合成；其它试剂均为分析纯，国内生产。
1.3 方法
石蜡包埋组织中DNA模板的提取[3]：每份标本切5μm厚切片，苏木素-伊红（Hematoxylin-Eosin，HE）染色后经光学显微镜下鉴定组织。另连续切4片，置2mL无菌Eppendorf试管分装。脱蜡：每管加二甲苯1 000μL，溶解30min，14 000rpm离心5min，弃上清；沉淀中加二甲苯1 000μL，溶解30min，离心5min，弃上清；加无水乙醇1 000μL，翻转混匀2min，离心5min，弃上清；加无水乙醇1000μL，再翻转混匀2min，离心5min，弃上清；加75%乙醇1 000μL，翻转混匀2min，离心5min，弃上清；加丙酮500μL，翻转混匀2min，离心5min，弃上清；置55℃水浴干燥5min。消化：每管加Lysis BufferⅡ（含蛋白K）200μL，置55℃水浴2h，95℃水浴灭活蛋白酶10min，置-20℃保存做PCR模板。
PCR扩增[4]：30μL反应体系中含20×buffer 1.5μL，1.7mmol/L MgCl 1.8μL，各200μmol/L的四种dNTP .3μL，0.5mmol/L的引物各0.2μL，模板4μL，Taq DNA聚合酶1.5~2U，双蒸水补到30μL。反应步骤：94℃预变性300s，然后进入循环，94℃变性45s，55℃退火45s，75℃延伸45s，共进行35个循环。最后72℃延伸300s。
PCR产物的鉴定：在30μL扩增产物中加入0.25%溴酚兰和0.25二甲苯菁一滴，在含有10mg/mL溴化乙碇的3%琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TBE，电压100V，电流10mA/cm2，时间30~40min。电泳结束后紫外灯下观察结果。
2 结果
37例胰腺癌中有19例提取到完整DNA，占51.3%（19/37）。其余由于标本存放时间长和DNA提取时造成基因断裂。在提出的19份DNA中，C-K-ras基因12位密码子突变的7例，占36.8%（7/19），总突变方式8，其中两种突变的1例（GAT，GTT）占12.5%（1/8），GGT 1例占12.5%（1/8），GTT 3例占37.5%（3/8），GAT 4例占50.0%（4/8）。胰腺恶性淋巴瘤1例、胰腺多形细胞癌2例、慢性胰腺炎5例均无突变。在提出完整DNA19份标本中，Rb基因第21外显子突变的有9例，占47.4%（9/19），而胰腺恶性淋巴瘤1例、胰腺多形细胞癌2例、慢性胰腺炎5例均未见C-K-ras基因12位密码子和Rb基因第21外显子突变。
3 讨论
Ras癌基因家族中有三种Ras原癌基因，据报道与胰腺癌有关的是C-K-ras癌基因。Ras基因编码的蛋白质大约有90%氨基酸序列同源，分子量为21 000道尔顿，故称之为P21蛋白（Ras蛋白）。该蛋白位于细胞膜的内表面，在细胞增殖信号传导过程中起枢纽作用。许多受体都通过活化Ras蛋白而将增殖信号传入细胞内部。P21蛋白属于GTP酶超家族，能与GTP或GDP结合，并可催化GTP水解为GDP和无机磷酸，Ras基因突变在肿瘤中非常普遍。Ras基因致癌的分子基础目前认为主要是点突变。所有Ras基因点突变的位置都在第12、13、61位密码子。其中绝大多数点突变在第12位密码子。野生型P21蛋白第12位为甘氨酸，其对应的Ras基因编码链的核苷酸是GGT。K-ras基因点突变一般会出现六种类型[5]：如果核苷酸突变为CGT、TGT、AGT、GCT、GTT、GAT，12位甘氨酸分别被精氨酸、半脱氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸取代。但是较常见的突变形式依次是GAT（Asp）、GTT（Val）和GGT(Arg)。PCR-SSP检测法[6]根据K-ras基因对应的12位密码子三种主要突变形式设计的特异引物。三种编码链P1、P2、P3的3′端碱基分别对应编码链的GGT中的第一个碱基G→C、第二个碱基G→T或A，模板链为共同的引物P4。P1与P4扩增出CGT型突变，产物长89bp；P2-P4、P3-P4分别扩增出GTT、GAT型突变，产物长88bp。由于经费欠缺在设计引物时我们只设计了三种，其它三种未做。这也是我们的检测结果在胰腺癌中C-K-ras点突变发生率低的缘故，因为可能存在的其他三种突变没有设计引物故不能表现出来。还有C-K-ras点突变也发生在13和16位点；胰腺癌C-K-ras除点突变外还有别的突变类型有待进一步研究。C-K-ras突变会影响P21蛋白的构象，进而影响与鸟苷酸的相互作用。它们或者降低GTP酶的活性，不能使GTP水解为GDP，或者提高GTP取代GDP的效率，因为P21蛋白与GTP结合为活化状态，而与GDP结合则失活，结果导致P21蛋白更多的处于活化状态，并持续向细胞内发送增殖信号，促使细胞过度增殖，形成肿瘤。
Rb基因是第一个被克隆的抑癌基因，最初发现于儿童的视网膜母细胞瘤（retinoblestoma），因此称为Rb基因， Rb基因定位于人类13号染色体q14，全长200kb，有27个外显子，26个内含子，编码具有928个氨基酸残基 (p105)。Rb蛋白可被磷酸化和去磷酸化。磷酸化的Rb蛋白是Rb基因调节细胞分化的主要形式。未磷酸化或低磷酸化的Rb蛋白是非活化型，与细胞内多种蛋白质结合，其中转录因子E-2F被Rb蛋白结合时，不能发挥转录因子的作用，其活性处于抑制状态。当Rb蛋白被磷酸化时，Rb蛋白失去结合其它蛋白能力，转录因子E-2F被释放出来，进而与特异性DNA序列结合，从而激活一系列与核酸合成有关的酶的基因表达。这些基因包括DNA聚合酶а、二氢叶酸还原酶、胸苷激酶等。Rb基因的抗癌性有两种含义：一是在正常细胞中Rb蛋白具有抑制细胞生长的作用；二是在肿瘤细胞内Rb基因具有抑制其生长及致瘤作用。利用Rb基因探讨和抗Rb蛋白的抗体检测正常人体组织及其相应的肿瘤组织，发现正常人体组织Rb基因的结构及表达均正常，而相应的肿瘤组织中的基因缺失突变，缺乏正常的Rb蛋白。人们用逆转录病毒感染的方法将正常Rb基因导入视网膜母细胞瘤、膀胱癌、肺癌等癌细胞株，结果Rb基因都可不同程度地抑制这些癌细胞株在裸鼠体内的致癌性。这些结果为Rb基因的抗癌性提供了直接的证据。
通过检测肿瘤相关基因的结构，分析肿瘤相关基因的缺陷和表达功能，以达到肿瘤的基因诊断目的。在肿瘤的基因诊断中，PCR技术具有简单快速、特异性强、敏感性高、对样本DNA要求不高等优点。所以我们选用PCR-SSP法分析胰腺癌标本C-K-ras基因、Rb基因点突变与胰腺癌的关系，为胰腺癌的早期诊断寻找一种可行的方法。
参考文献
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patients with pancreatic adenocarcinoma[J]. Cancer Res， 1993，53(11):2472-2474.