作者：苏燕 邵国 高嵩单 于明华 修瑞娟
【摘要】 目的：建立一种简便快速的重叠延伸PCR基因定点突变方法。方法：采用重叠延伸PCR的方法将人TGF-β2基因启动子区（-270bp~+280bp）-114bp的5'CGTG3'序列定点突变为5'TTTG3'，前两次PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后无需纯化，直接将胶条切下置于EP管中，-80℃冷冻10min，然后将胶条离心后分别取上清液作为模板进行第三次PCR，以获得全长的突变目的基因，最后将此突变基因插入报告载体pGL3-Basic进行基因测序。结果：人TGF-β2基因启动子区突变序列的测序结果与预期完全一致。结论：此方法简便经济、突变准确，是一种非常实用的基因定点突变方法。
【关键词】 重叠延伸PCR；基因突变；基因测序
Overlap-extension PCR was used to mutagenate human TGF-β2 gene promoter (-270bp~+280bp）-114bp region from 5'CGTG3' to 5' TTTG3'. The first two PCR products were electrophoresised on agarose-gel， instead of purification， theaimed segments gel were cut down and put into EP at -80℃ for 10-20min cool， then the gel were centrifuged and thesupernatants were used as template for the third PCR. The final PCR segment was cloned into pGL3-basic forsequencing. Results: huaman TGF-β2 gene promoter mutant had been successfully constructed. Conclusion: The methodwas effective and simple for site-directed mutagenesis construction.
Key wordsOverlap-extention PCR; Mutagenesis; Gene sequencing
随着分子生物学研究的突飞猛进，基因定点突变技术成为一项重要的分子生物学实验技术手段，在基因表达及蛋白质的结构与功能之间关系等方面的研究中得到广泛的应用。常用的定点突变方法主要有寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变及盒式突变。目前，PCR介导的定点突变技术是使用最普遍的定点突变方法，以PCR为基础的突变方法一般有大引物突变、重叠延伸突变及一步快速突变。重叠延伸突变PCR可以在DNA区段的任何位置突变，且可以在侧引物的两端设计酶切位点，方便进一步的连接克隆[1-2]。本研究对传统重叠延伸PCR法进行定点突变的实验方法进行了改进，进一步节约了实验成本，缩短了实验周期，是一种简便、经济、快速、准确的基因定点突变方法。
1 材料与方法
1.1 材料Pyrobest TaqDNA Polymerase、dNTP、T4 DNA连接酶、限制性内切酶MluⅠ和BglⅡ及琼脂糖购自大连宝生物工程有限公司，凝胶回收和质粒提取试剂盒购自北京鼎国生物技术有限责任公司，报告载体pGL3-Basic购自Promega公司。引物（引物1：5'GTATCAACGCGTAAAACGGGAGACTTGATTGT3'，引物2：5' GATCTAAGATCTATTGCTCGCTTAGGGTAGG3'，引物3：5'ACCAAAAGCTCTCCCCGAAC3'，引物4：5' GGGAGAGCTTTTGGTCTAAGTA3' ）由上海生物工程有限责任公司合成，其他试剂均为进口分装。
1.2 方法
1.2.1 正常人TGF-β2基因-270bp~+280bp启动子区报告基因的构建 首先利用引物1、引物2从人血DNA中扩增人TGF-β2基因启动子区-270bp~+280bp的基因区段，然后将此PCR产物进行凝胶回收，回收片段与载体pGL3-Basic分别经MluⅠ和BglⅡ双酶切后进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，经克隆培养后挑取阳性菌落进行培养，提取质粒后送公司测序。
1.2.2 人TGF-β2基因启动子区突变体基因的构建
根据人TGF-β2基因启动子区-114位的待突变序列5'CGTG3'设计合成相应的带有突变位点序列的正向和反向特异性引物3和4，两个带有突变位点的引物的5' 端重叠约30个碱基，且突变点位于重叠碱基的中央。然后根据定点突变的方法[3-4]，分别利用引物1和4以及2和3扩增突变位点两侧的DNA序列。PCR反应总体积20.0μL：10×Buffer 2.0μL， TaqDNA polymerase 0.2μL， dNTP(25mmol/L) 1.6μL，引物 (10μmol/L)各1.0μL，模板1.0μL，蒸馏水13.2μL。PCR循环条件为94℃预变性3min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环；末次循环后，72℃再延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，将两个目的片段分别用刀片在紫外灯下切下，装入EP管，置-80℃低温冰箱冷冻10~20min后取出，用高速离心机以10 000rpm/min离心5min，将包含目的片段的上清液吸出备用。最后配置反应管，向其中加入引物1和2、TaqE、dNTP以及上述上清液各2.0μL，进行第三次PCR。反应结束后，将PCR产物进行回收，经酶切、连接、转化等步骤后克隆到pGL3-Basic报告基因载体中，送上海生物工程公司测序。
2 结果
2.1 重叠延伸PCR扩增人TGF-β2基因启动子区-114bp区突变基因 Ⅰ和Ⅱ分别为5' 端带有突变位点的短片段PCR产物，Ⅲ是以Ⅰ和Ⅱ为模板进行延伸并扩增得到的带有突变位点的564bpPCR产物，见图1。
2.2 突变基因的测序质粒测序结果显示，人TGF-β2基因启动子区-114位的5'CGTG3'序列成功突变为5'TTTG3'，见图2。
3 讨论
经典重叠延伸PCR技术必需在特定的待突变位点和上下游分别设计引物，1 、3 为上下游引物，2 、4为突变引物(且2 、4的5'端部分互补)，先以引物1 、3 在一定条件下进行PCR ，得产物Ⅰ，再以引物2 、4进行PCR 得产物Ⅱ，将产物Ⅰ 和Ⅱ分别纯化回收后，将Ⅰ 和Ⅱ混合作为模板，以1 、4为引物进行PCR，即可得到带突变位点的DNA 片段。将其装入特定的载体中，转化入相应的宿主菌，扩增后经鉴定得到了带有突变位点的目的DNA[3-4]。本实验对经典的重叠延伸PCR技术进行了改进，采用琼脂糖凝胶条冻融的方法取代了对产物Ⅰ 和Ⅱ的纯化回收，用含有目的片段的凝胶条冻出液作为第三次PCR的模板进行突变片段的扩增，不仅节约了实验成本，缩短了实验周期，而且取得了很好的实验效果，是一种非常简便、快速、实用的实验方法。
参考文献
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基金项目：中科院知识创新工程，NO.KJCX1-SW-07