作者：何天峰， 张树辉， 李连波， 杨文佳， 朱俊， 陈云飞
【摘要】 目的：观察针刺对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织病理改变、滑膜肥大细胞脱颗粒及类胰蛋白酶表达的影响，探讨肥大细胞功能与针刺治疗大鼠佐剂性关节炎的关系。方法：46只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组（n=16）、模型组（n=15）和针刺组（n=15）。除正常对照组外，其余大鼠通过足垫部注射0.1 mL弗氏完全佐剂建立佐剂性关节炎模型。针刺组隔天针刺双侧足三里、悬钟、肾俞穴，每次15 min，共8次。治疗期间，正常对照组和模型组除不予针刺外，其余处理均同针刺组。设造模当天为实验第0天，之后每3天对大鼠的体质量和足跖体积进行测量并记录。治疗结束后，取所有大鼠右后踝关节滑膜组织，HE染色后根据滑膜病理5级评分法评价滑膜组织病理改变，甲苯胺蓝染色法观察滑膜肥大细胞数量及其脱颗粒情况，免疫组织化学法检测类胰蛋白酶在滑膜组织中的表达情况。结果：与模型组比较，针刺组大鼠治疗后体质量明显增加（P&<0.05），足跖体积明显减小（P&<0.01）。HE染色显示，针刺可显著减轻佐剂性关节炎大鼠滑膜组织中的炎细胞浸润、滑膜细胞增生和滑膜纤维组织增生等病理表现（P&<0.05）；甲苯胺蓝染色显示，与正常对照组比较，模型组大鼠滑膜肥大细胞数量和脱颗粒率均明显增加（P&<0.01），而针刺组大鼠滑膜肥大细胞数量和脱颗粒率的上升得到有效抑制，与模型组比较差异有统计学意义（P&<0.01）；免疫组织化学检测显示，针刺可显著抑制佐剂性关节炎大鼠滑膜组织中上调的类胰蛋白酶表达（P&<0.01）。相关分析显示，滑膜肥大细胞数量及脱颗粒率均与滑膜组织病理改变总评分呈明显的正相关（P&<0.01）。结论：针刺具有治疗大鼠早期佐剂性关节炎和调节滑膜肥大细胞功能的作用，由于两者间存在明显的正相关性，因此针刺可能通过抑制滑膜肥大细胞功能，对佐剂性关节炎大鼠起治疗作用。
【关键词】 针刺; 肥大细胞; 细胞脱颗粒; 类胰蛋白酶; 关节炎， 实验性; 大鼠
Objective: To observe the effects of acupuncture on synovial pathology， synovial mast cell degranulation and tryptase expression and to investigate the relationship between the functions of mast cells and effects of acupuncture on early adjuvant arthritis in rats.
Methods: Fortysix male Wistar rats were randomly pided into normal control group (n=16)， untreated group (n=15) and acupuncture group (n=15). Adjuvant arthritis was induced by injection of 0.1 mL Freund’s complete adjuvant in right hind limb footpad. Normal control group and untreated group received no acupuncture treatment， while rats in the acupuncture group were treated with sterilized disposable stainless steel needles inserted perpendicularly as deep as 2 to 3 mm at Xuanzhong (GB39)， 6 mm at Shenshu (BL23) and 7 mm at Zusanli (ST36) for eight times (15 min each time) every two days. Setting the modeling day as the 0 day of the experiment， the body weight and paw volume of the rats were measured every three days from the 0 day. In the end， synovial tissues of the right hind ankles were sampled and made into paraffin sections. Then they were firstly stained with hematoxylineosin for observing synovial pathology to evaluate the effects of acupuncture on adjuvant arthritis， then stained with toluidine blue for observing the number and degranulation ratio of synovial mast cells and finally detected by immunohistochemical staining method to investigate the expression of tryptase in synovium.
Results: Compared with the untreated group， the body weight of rats in the acpuncture group was increased significantly (P&<0.05)， while the paw volume decreased obviously (P&<0.01). Hematoxylineosin staining showed that acupuncture significantly inhibited inflammatory cell infiltration， synovial cell hyperplasia， and synovial fibroplasia in synovium of rats with adjuvant arthritis as compared with the untreated group (P&<0.05). Toluidine blue staining showed that acupuncture could significantly diminish the numbers of total and degranulated mast cells in rats with adjuvant arthritis (P&<0.01)， which were significantly higher in the untreated group than in the normal control group (P&<0.01). Showing by immunohistochemical staining， the expression of tryptase in synovium in the acupuncture group was decreased as compared with the untreated group (P&<0.01). Analyzed by Spearman’s bivariate correlation， the number of mast cells and degranulation ratio of mast cells were positively correlated with the pathological scores (r=0.837， P&<0.01; r=0.634， P&<0.01).
Conclusion: Acupuncture can improve pathological condition of inflammatory synovium in rats with early adjuvant arthritis by inhibiting the function of synovial mast cells， which may play an important underlying role in the immunoregulation of acupuncture on adjuvant arthritis.
Keywords: acupuncture; mast cells; cell degranulation; tryptase; arthritis， experimental; rats
针灸能够双向调节免疫，在抗感染、抗炎和抗肿瘤等方面发挥着积极的作用，临床常被用于免疫性疾病如变态反应性疾病、慢性炎症和自身免疫性疾病等的防治［13］，这与针灸能够调节多种免疫细胞和免疫分子有重要的关系［4］。临床实践表明，针灸治疗类风湿关节炎具有较好的疗效，实验研究也证实电针能够改善关节炎小鼠的多项免疫指标［58］。肥大细胞是疏松结缔组织内的一种常见且重要的免疫细胞，与免疫分子及其他免疫细胞有着广泛的联系，但由于肥大细胞分布和功能的特点，以往肥大细胞与针灸效应的相关研究多集中在针刺镇痛领域，而肥大细胞在针灸调节免疫中的作用及机制研究较少［9］。目前已有研究表明肥大细胞在类风湿关节炎的发病过程中起着重要的作用，而其在针灸治疗类风湿关节炎中的作用尚不清楚［10］。类胰蛋白酶是肥大细胞内含量最高的蛋白质成分，几乎全部存在于肥大细胞内，是普遍采用的肥大细胞特异性标记物［11］。本实验采用佐剂性关节炎大鼠模型，观察针刺对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织病理改变、滑膜肥大细胞脱颗粒和类胰蛋白酶表达的影响，探讨肥大细胞功能与针刺治疗大鼠佐剂性关节炎的关系。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
清洁级雄性Wistar大鼠46只，体质量（160.5±14.5）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物生产许可证号为SCXK（沪）20070005。所有大鼠均在上海中医药大学岳阳西医结合">中西医结合医院动物实验中心饲养，动物实验室许可证号为SYXK（沪）20060001，给予自然照明、常规饮水和饮食。大鼠在正式实验前进行1周的适应性喂养。
1.1.2 主要仪器
全自动石蜡包埋机、组织脱水机（日本Sakura公司），轮转式切片机（德国Leica公司），BX51型光学显微镜（日本Olympus公司），ImagePro Plus 6.0图像分析系统（美国Media Cybernetics公司），FA1104型电子天平（上海天平仪器厂），足跖容积测量仪（上海医药工业研究院）。
1.1.3 主要试剂
弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant，FCA），美国Sigma公司生产，批号为047K8710；甲苯胺蓝(toluidine blue， TB)，上海如吉生物技术有限公司生产，批号为20080422；小鼠抗大鼠肥大细胞类胰蛋白酶单克隆抗体，美国Imgenex公司生产，批号为H528；脱蜡修复液，上海立瑶生物科技有限公司生产；二抗检测系统（广谱），基因科技（上海）有限公司生产，批号为18S1775A。
1.2 实验分组和处理
1.2.1 分组方法
46只大鼠按随机数字表法分为正常对照组16只、模型组15只和针刺组15只。
1.2.2 动物模型建立方法
根据
参考文献
［12］建立佐剂性关节炎模型，于实验开始时在需造模大鼠右后足跖皮下进针至距小腿关节（踝关节）注射FCA 0.1 mL。造模24 h后，造模大鼠右后足跖均出现不同程度的红肿，3 d后，造模大鼠与正常对照组大鼠足跖体积比较差异有统计学意义，说明关节炎模型制作成功。1.2.3 各组处理方法
模型组和针刺组大鼠建立佐剂性关节炎模型，正常对照组大鼠不造模。设造模当天为实验第0天，实验第3天（72 h后）开始，针刺组大鼠给予针刺治疗，隔天1次，共8次。针刺方法：抓取、固定大鼠，取双侧悬钟（后肢外踝尖上10 mm处）、足三里（膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处）和肾俞（第2腰椎下两旁），用0.30 mm×25 mm毫针进行针刺，留针15 min。穴位定位、针刺方法及注意事项参照
参考文献
［13］。针刺组治疗期间，模型组和正常对照组大鼠抓取、固定，但不针刺，随后置于笼中15 min。1.3 指标测定
1.3.1 体质量和足跖体积的测量
从造模当天（实验第0天）开始，对大鼠的体质量和足跖体积进行测量，每3天记录1次直至实验结束。足跖体积的测量参照
参考文献
［14］，使用足跖容积测量仪测量。1.3.2 标本制备
末次治疗后，大鼠禁食24 h，腹腔注射盐酸氯胺酮（100 mg/kg）麻醉，参照
参考文献
［15］，用剪刀分开踝关节皮肤，分离踝关节周围的肌肉、肌腱等组织，暴露踝关节，沿踝关节骨周围将滑膜取出，10%中性甲醛溶液固定24 h，常规石蜡包埋制片。1.3.3 滑膜组织病理观察和评价
石蜡切片采用苏木素伊红（hematoxylineosin，HE）染色，光学显微镜下观察滑膜的病理改变。参照
参考文献
［12］，采用滑膜病理5级评分法，由两名病理医师盲法观察，对滑膜组织的炎细胞浸润、滑膜细胞增生和滑膜纤维组织增生情况进行评分，求平均值。1.3.4 滑膜肥大细胞及脱颗粒观察
石蜡切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水后，用0.5% TB溶液染色10 min，水洗后入冰醋酸液分化直到胞核和颗粒清晰，常规脱水、透明后封片。染色切片由1名病理医师于光学显微镜下盲法观察肥大细胞形态并计数。形态判定方法为：细胞膜完整、细胞核染色清楚的为稳定状态肥大细胞；细胞膜破裂、周围组织中存在蓝染状颗粒的为脱颗粒肥大细胞。计数方法为：每张切片在高倍视野（×400）下选取肥大细胞数目最多的3个视野进行计数，计算3个视野肥大细胞总数和脱颗粒率各自的平均值。脱颗粒率=（脱颗粒肥大细胞数/肥大细胞总数）×100%。
1.3.5 滑膜组织类胰蛋白酶表达的检测
采用免疫组织化学EnVision二步法。石蜡切片经常规脱蜡水化，用脱蜡修复液(pH 6.0)微波修复抗原，滴加小鼠抗大鼠肥大细胞类胰蛋白酶抗体，冰箱4 ℃孵育过夜，PBS冲洗后，滴加ChemMateTM EnVision+/辣根过氧化物酶（抗兔/小鼠），孵育30 min，再用PBS冲洗后，根据试剂盒说明书配制DAB工作液显色，苏木素复染，脱水、透明后封片。染色切片由1名病理医师光学显微镜下盲法观察，以细胞膜或细胞质内出现棕黄色物质者为阳性细胞，每张切片选取阳性表达最强的3个高倍视野(×400)，计数每个视野中阳性细胞的数量，求平均值。
1.4 统计学方法
采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料数据以x±s表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用LSDt检验；滑膜肥大细胞数量及脱颗粒率和佐剂性关节炎大鼠滑膜组织病理改变总评分间的相关性分析采用Spearman秩相关分析。检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 针刺对佐剂性关节炎大鼠体质量的影响
与正常对照组大鼠比较，实验第3天，经FCA造模大鼠的体质量明显下降（P&<0.05），针刺组大鼠体质量低于模型组，但差异无统计学意义（P&>0.05）。在针刺足三里、悬钟、肾俞穴进行治疗的过程中，模型组和针刺组大鼠体质量较正常对照组下降（P&<0.01，P&<0.05），针刺组大鼠体质量却较模型组增加，但差异无统计学意义（P&>0.05）。治疗结束后，模型组和针刺组大鼠体质量比较，差异有统计学意义（P&<0.05）。见表1。表1 各组大鼠体质量（略）Table 1 Body weight of rats in different groups(略)
2.2 针刺对佐剂性关节炎大鼠足跖体积的影响
与正常对照组大鼠比较，经FCA造模后，模型组大鼠足跖体积明显增加（P&<0.01）。针刺组大鼠在经针刺足三里、悬钟、肾俞治疗后，足跖体积逐渐下降，至实验第15天，足跖体积较模型组明显减小（P&<0.01），直到治疗结束（P&<0.01）。见表2。表2 各组大鼠足跖体积（略）Table 2 Paw volume of rats in different groups(略)
2.3 针刺对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织病理改变的影响
正常对照组大鼠滑膜组织只有少量散在淋巴细胞浸润。模型组大鼠滑膜组织与正常对照组大鼠比较，表现出了关节炎的典型特点，均存在明显的炎细胞浸润，部分出现滑膜细胞、滑膜纤维组织增生。针刺组滑膜炎症明显减轻，滑膜细胞、滑膜纤维组织增生也有不同程度的改善。见图1。
病理评分结果显示，模型组大鼠滑膜组织的炎细胞浸润、滑膜细胞增生以及滑膜纤维组织增生等病理改变较正常对照组均显著增高（P&<0.05），针刺组大鼠经治疗后，3项病理表现的评分以及总评分都较模型组明显降低（P&<0.01）。见表3。表3 大鼠滑膜组织病理评分结果（略）Table 3 Pathological scores of synovium of rats in different groups(略)
2.4 针刺对佐剂性关节炎大鼠滑膜肥大细胞数量及其脱颗粒情况的影响
正常对照组大鼠关节滑膜中有正常寄居的肥大细胞，但数量较少（图2A）。模型组大鼠经FCA造模后，滑膜部位的肥大细胞数量显著增加，脱颗粒率也明显上升（图2B），均明显高于正常对照组（P&<0.01）；针刺组大鼠滑膜部位仍存在较多的未脱颗粒和脱颗粒肥大细胞（图2C），其总数和脱颗粒率仍明显高于正常对照组（P&<0.01），但与模型组相比，其总数和脱颗粒率明显减少（P&<0.01）。见表4。表4 各组大鼠滑膜肥大细胞数量、脱颗粒率和滑膜组织类胰蛋白酶阳性细胞数（略）Table 4 Number and degranulation ratio of mast cells and tryptasepositive cells in synovium of rats in different groups(略)
2.5 针刺对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织中类胰蛋白酶表达的影响
在正常大鼠的滑膜组织中有少量类胰蛋白酶表达（图3A）。大鼠经FCA造模后，滑膜组织中的类胰蛋白酶表达明显增多（图3B），类胰蛋白酶阳性细胞的计数显著高于正常对照组（P&<0.01），针刺组大鼠滑膜组织类胰蛋白酶阳性细胞的数量少于模型组（图3C），差异有统计学意义（P&<0.01）。见表4。
2.6 滑膜肥大细胞表达和关节炎大鼠滑膜组织病理改变的相关性分析
Spearman秩相关分析结果显示，滑膜肥大细胞数量及脱颗粒率与关节炎大鼠滑膜组织病理改变总评分的结果呈明显的正相关（r=0.837，P&<0.01；r=0.634，P&<0.01），提示针刺可能通过抑制滑膜肥大细胞的数量和脱颗粒，改善佐剂性关节炎大鼠滑膜组织的病理改变。见表5。表5 滑膜肥大细胞和关节炎大鼠滑膜组织病理改变的相关性分析（略）Table 5 Correlation analysis between synovial mast cells and pathological scores of synovium in rats with adjuvant arthritis
IndexPathological scores (Spearman correlation)（略）
3 讨论
类风湿关节炎是以慢性对称性多关节炎症为主要表现的一种全身性自身免疫性疾病。目前西医治疗类风湿关节炎尚无特别有效的疗法，临床上常用非甾体抗炎药和激素等缓解病情，但副作用大，并且减量后病情容易反跳。针灸治疗类风湿关节炎具有较好的疗效［57］，但其作用机制尚不清楚。中医认为类风湿关节炎属于“痹证”范畴，病机为本虚标实，与肝、脾、肾关系密切，其中又以肾精不足为本［12， 16］ 。肾主骨，骨的生长发育乃至损伤以后的修复，需依靠肾精的滋养。肾俞为肾之背俞穴，具有益肾气的功用，又是足太阳膀胱经穴。足三里是常用的强壮要穴，主治下肢痿痹，同时也是足阳明胃经的主穴之一。两穴均有补益之功，可补肾健脾，并且两穴所在经脉又都循行而过下肢关节，根据“经脉所过，主治所及”的远部取穴原则，选取肾俞和足三里作为主穴。悬钟为八会穴之髓会，与骨和髓关系密切，能疏通经络，根据近部取穴的原则，选“悬钟”舒筋健骨，并配合“肾俞”和“足三里”，远近取穴。因此取穴方案选用足三里振奋中阳而补土，配肾俞以壮先天之精气，并局部配以悬钟。
本实验采用的大鼠佐剂性关节炎模型是一种免疫性炎症模型，与人类类风湿关节炎的关节病理改变较为相似，是国内外研究类风湿关节炎最常用的动物模型。本实验采用该模型进行足三里、肾俞、悬钟的针刺治疗，结果表明大鼠在注射FCA造模后，关节发生明显肿胀，关节滑膜出现了严重的炎症和滑膜细胞、纤维组织增生，这与Shin等［17］的研究结果一致。佐剂性关节炎所引起的足跖肿胀通常在持续3 d后逐渐减轻，8 d后再度肿胀［18］。本实验观察到针刺组大鼠在进行针刺治疗后，足跖体积明显小于模型组，不但促使了实验第0～9天大鼠足跖肿胀情况的恢复，而且还抑制了第9～18天出现的再度肿胀；另外，关节滑膜的病理表现较模型组也显著减轻，表明针刺对大鼠佐剂性关节炎具有抗炎消肿的作用，能缓解佐剂性关节炎大鼠关节肿胀的症状，阻止滑膜部位病变的发展。
研究表明，肥大细胞与先天性和获得性两大免疫体系中的多种疾病，如哮喘、变应性鼻炎等IgE介导的变态反应性疾病存在密切联系［19， 20］。目前，无论是临床试验还是动物实验，均已证实肥大细胞在类风湿关节炎的病变过程中起着重要的作用，可能通过释放组胺、蛋白水解酶、花生四烯酸产物以及细胞因子等炎性介质，维持或加重滑膜炎症及对关节结构的破坏［17， 21， 22］。针刺与肥大细胞的相关研究大多侧重于肥大细胞与经络实质或针刺镇痛效应关系的探索［9， 23］，认为针刺能够促使肥大细胞在针刺穴位及所属经络上聚集，但在炎性病变局部则正好相反。李熳等［24］发现，福尔马林所致的炎性痛大鼠经电针治疗后，针刺穴位皮下的肥大细胞数量增加，而病灶局部皮下肥大细胞数量却明显减少，表明肥大细胞可能参与了福尔马林所致的炎性痛反应过程；类似的结果在胃溃疡［25］和过敏性鼻炎［26］模型大鼠上也得到了证实。另外Shin等［17］的研究显示关节炎小鼠的滑膜组织中肥大细胞数量显著增加。本研究结果显示，大鼠在注射FCA造模后，关节滑膜组织肥大细胞的数量和脱颗粒率较正常对照组大鼠明显升高，针刺治疗后佐剂性关节炎大鼠的滑膜组织病理改变有明显改善，与模型组比较，肥大细胞的数量和脱颗粒率均显著减少。相关性分析结果证实，滑膜肥大细胞数量及其脱颗粒率确与滑膜组织的病理改变存在显著相关，因此我们推测针刺对佐剂性关节炎大鼠滑膜病理改变的改善作用，部分可能是通过抑制肥大细胞功能来实现的。
尽管目前已有证据表明针刺对于病变局部（多为炎症病灶）的肥大细胞存在影响［24， 26， 27］，但其机制却仍不清楚。以往的研究结果认为，肥大细胞在经络循行的过程中起着传递信号的作用，这可能与肥大细胞的脱颗粒介质密切相关，因为肥大细胞的脱颗粒介质可作用于血管、交感神经，影响体液的循行［28］；也有人发现肥大细胞与神经之间存在着联系［29］。尽管如此，既有的这些结果仍不能完全解释针刺对肥大细胞的趋化、募集以及脱颗粒作用的机制，因此在针刺治疗过程中，肥大细胞所起的作用及具体机制，尚有待继续研究。
类胰蛋白酶是肥大细胞的特异性蛋白酶，本实验研究结果显示类胰蛋白酶免疫组织化学染色与甲苯胺蓝特殊染色所得到的结果一致，但类胰蛋白酶标记的细胞数却少于特殊染色所得到的肥大细胞数，这可能与肥大细胞脱颗粒有关，肥大细胞在受到刺激后脱颗粒，释放类胰蛋白酶、组胺等介质，参与炎症反应。其确切的原因和机制也还需进一步研究。
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