补阳还五汤及其有效组分和三七总皂苷含药血浆抗血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖的作用

【摘要】 目的：研究补阳还五汤及其有效组分和三七总皂苷（total Panax notoginseng saponins，TSPN)含药血浆对血小板衍生生长因子（plateletderived growth factor，PDGF）诱导的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖的影响。方法：采用血浆药理学方法及PDGFBB诱导VSMC增殖模型。以甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测空白血浆对VSMC生长的影响和含药血浆对PDGFBB诱导的VSMC增殖的半数抑制浓度，确定补阳还五汤及其有效组分和三七总皂苷用药浓度。MTT法和流式细胞术检测补阳还五汤及有效组分和TSPN、阿托伐他汀对VSMC增殖活性及细胞周期的影响。结果：PDGFBB剌激后，VSMC增殖活性显著增强，G0/G1期细胞数减少，G2/M期和S期细胞数增多。与PDGFBB剌激组比较，补阳还五汤、有效组分生物碱和苷、TSPN、阿托伐他汀等含药血浆均可抑制PDGFBB诱导的VSMC增殖，增加G0/G1期细胞数，减少G2/M期和S期细胞数。结论：补阳还五汤及其有效组分和TSPN均可抑制PDGFBB诱导的VSMC增殖。生物碱和苷可能为补阳还五汤中抗VSMC增殖的主要药效物质，补阳还五汤及其有效组分生物碱和苷具有与阿托伐他汀、TSPN相似的抗VSMC增殖的作用。

【关键词】 补阳还五汤; 生物碱; 苷; 三七总皂苷; 血浆药理学; 血管平滑肌细胞; 细胞增殖

　　Objective: To explore the effects of plasma containing Buyang Huanwu Decoction (BYHWD)， a compound of traditional Chinese medicine， and its effective components (alkaloids and glycosides) and total Panax notoginseng saponins (TSPN) on vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation induced by plateletderived growth factor (PDGF) in vitro.

　　Methods: VSMC proliferation was induced by incubating VSMCs with PDGFBB. Effects of different concentrations of blank plasma on the VSMC proliferation and 50% inhibitory concentrations of plasma containing BYHWD， its alkaloids and glycosides， TSPN and atorvastatin were detected by using methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method to determine the concentrations of plasma containing drugs for the following experiments. Then， MTT and flow cytometry methods were used to detect the effects of plasma containing BYHWD， its alkaloids and glycosides， TSPN and atorvastatin on VSMC proliferative activity and cell cycles.

　　Results: VSMC proliferative activity was enhanced obviously after PDGFBB stimulation. The cell number in G0/G1 phase was decreased and the cell quantity in G2/M and S phases was increased following PDGFBB stimulation. Compared with PDGFBB stimulation group， VSMC proliferation induced by PDGFBB in plasma containing BYHWD， its alkaloids and glycosides， TSPN and atorvastatin groups was inhibited. In all plasma containing drug components groups， the cell number of G0/G1 phase was higher and the cell quantity of G2/M and S phases was lower than those in the PDGFBB stimulation group.

　　Conclusion: BYHWD and its alkaloids and glycosides have similar roles of resisting VSMC proliferation to TSPN and atorvastatin. Alkaloids and glycosides may be the major effective substances of antiVSMC proliferation in BYHWD.

　　Keywords: Buyang Huanwu Decoction; alkaloids; glycoside; total Panax notoginseng saponins; plasma pharmacology; vascular smooth muscle cell; cell proliferation

　　血清药理学方法是给动物灌服中药或复方一定时间后，取其血清进行体外实验的一种方法［1］。尽管血清药理学方法在中药和复方药理研究中有重要的作用，但其局限性也日益受到关注。在制备血清时由于血液凝固等的影响，血清药理学方法并不符合中药在体内的真实过程，含药血清中的“药效物质”可能并不能正确反映中药的有效成分。因而有人提出了用含药血浆进行中药或复方体外实验的“血浆药理学（plasma pharmacology）”方法［2］，这种方法有可能成为中药药理研究的重要方法之一。
　　
　　补阳还五汤（Buyang Huanwu Decoction，BYHWD）为中医药治疗脑缺血、缺血性心脏病的有效方剂。我们的研究表明，该方中的生物碱、苷类组分为其主要的有效组分。该方及其有效组分生物碱和苷可抑制大鼠主动脉球囊导管损伤后血管内膜的增生，降低增生内膜中增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、cyclin D1、cyclin E和细胞外基质成分Ⅰ型胶原（collagen Ⅰ，ColⅠ)、纤联蛋白（fibronectin， FN）的表达，能抑制血管内膜损伤后血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）细胞周期的激活，阻抑细胞增殖，抑制细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的合成和促进其降解［3，4］。三七总皂苷（total Panax notoginseng saponins，TSPN）是从中药五加科植物Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen干燥根中提取的皂苷类有效组分，是三七的主要药理活性成分，在三七中含量高达8%～12%，其主要有效成分是人参皂苷Rg1（ginsenoside Rg1）、人参皂苷Rb1（ginsenoside Rb1）和三七皂苷R1（notoginsenoside R1）等。研究表明，TSPN可显著抑制高脂血清对VSMC的促增殖作用［5］，抑制主动脉球囊损伤血管内膜增生模型大鼠血管内膜增生，降低增生内膜中cyclin D1、cyclin E和FN的表达，增强基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9，MMP9)的表达，提示TSPN可抑制血管内膜损伤后VSMC的过度增殖，减少ECM的沉积［6］。由于VSMC在血管增殖性病变中具有重要的地位，为了进一步阐明补阳还五汤、补阳还五汤有效组分及TSPN的作用环节，本研究采用血浆药理学方法和血小板衍生生长因子(plateletderived growth factor，PDGF）诱导的VSMC增殖模型，研究补阳还五汤、 补阳还五汤有效组分和TSPN对VSMC增殖的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 实验动物 SpragueDawley大鼠，由湖南省卫生防疫站实验动物中心提供，体质量120～150 g，雌雄各半，合格证号为医动字第20010号。饲养在室温18～20 ℃，湿度65%～70%的环境中，自由饮水进食。

　　1.1.2 实验试剂 达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium， DMEM）和胰蛋白酶（1︰250）购自美国Gibico公司。DMEM培养基以超纯水配制，过滤除菌，－20 ℃保存。胰蛋白酶以超纯水配成0.25%溶液，过滤除菌后分装，－20 ℃保存。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），购自杭州四季青试剂公司，56 ℃灭活补体30 min，过滤除菌后分装，－20 ℃保存。甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、PDGFBB和二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），均购自Sigma公司。碘化丙啶（propidium iodide，PI）和RNA酶抑制剂（RNase inhibitor），均购自北京鼎国生物科技有限公司。其余试剂均为分析纯。

　　1.1.3 实验药物 补阳还五汤由黄芪60 g、赤芍9 g、川芎6 g、当归9 g、地龙9 g、红花9 g、桃仁9 g组成。按我们以往的方法［4］提取原方水提取物和其有效组分生物碱、苷。补阳还五汤生药浓度为1 g/mL。以高效液相色谱法测定各提取物中有效物质的含量。苷类组分中黄芪甲苷含量为1.40 mg/g，芍药苷为19.11 mg/g，苦杏仁苷为17.92 mg/g；补阳还五汤中含黄芪甲苷0.38 mg/g，芍药苷1.16 mg/g，苦杏仁苷0.90 mg/g；生物碱类组分中川芎嗪含量为6.00 mg/g；补阳还五汤中川芎嗪含量为0.01 mg/g。以去离子蒸馏水将苷类有效组分配成苷含量为0.71 g/mL的溶液，将生物碱类有效组分配成生物碱含量为0.08 g/mL的溶液待用。
　　
　　TSPN，购自广西梧州制药（集团）股份有限公司，批号为071119。经检验，TSPN为淡黄色无定形粉末，味苦微甜，易溶于水。用薄层色谱鉴别，具有人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的特征性斑点，水溶液pH 6.1。以高效液相色谱法测定其主要有效成分［6］，可见到人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的特征性色谱峰，含人参皂苷Rg1 50.4%，人参皂苷Rb1 30.9%，三七皂苷R1 12.5%。
　　
　　阿托伐他汀（atorvastatin)，10 mg/片，Godecke GmbH生产，辉瑞制药有限公司分装，批号为080117。临用时以去离子蒸馏水配成2 mg/mL混悬液。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 大鼠主动脉VSMC的培养和鉴定

　　1.2.1.1 原代细胞培养 采用组织贴块法培养原代细胞。每次取大鼠2～3只，处死，75%酒精消毒，切开胸腹部，无菌条件下分离胸腹主动脉，以Hank’s液洗净，剪去血管外小分支。移入含20% FBS的DMEM中，剪开血管腔，以镊子轻轻擦拭内膜层3～5次去除内皮细胞。然后将血管放入DMEM中（含20% FBS），剪碎血管至1 mm2左右大小。将组织块转入培养瓶中，均匀贴壁，组织块间距为0.5 cm。盖好瓶盖，轻轻翻转培养瓶使瓶底朝上，并向瓶内注入适量含20% FBS的DMEM液，于37 ℃、5% CO2培养箱内放置4～5 h，使组织块干涸，并与瓶底贴附。然后将培养瓶慢慢翻转平放，使组织块完全浸入培养液中，继续静置3～5 d。待有细胞从组织块周围游离出后，采用半量换液方式换液，2～3 d换液1次，待原代培养2～3周至细胞长成致密单层即可传代。

　　1.2.1.2 细胞传代及培养 取原代生长的VSMC，以Hank’s液洗涤后，加入0.25%胰蛋白酶消化，以FBS终止反应，DMEM洗涤后，以含20% FBS的DMEM制成106/mL细胞悬液进行传代培养，以1︰2的比例传代。

　　1.2.1.3 细胞鉴定 实验用4～6代VSMC。用免疫细胞化学法测定VSMC α平滑肌肌动蛋白的表达，进行细胞鉴定。

　　1.2.2 含药血浆的制备 按文献方法［7］将大鼠随机分为空白组、阿托伐他汀组、补阳还五汤组、生物碱组、苷组和TSPN组，每组10～12只。空白组灌胃等量蒸馏水（给药体积为10 mL/kg），补阳还五汤组灌胃补阳还五汤（生药量22.2 g/kg），生物碱组灌胃生物碱类有效组分（1.66 g/kg），苷组灌胃苷类有效组分（14.2 g/kg），TSPN组灌胃TSPN（200 mg/kg），阿托伐他汀组灌胃阿托伐他汀（20 mg/kg）。每天给药两次，分别在上午9时和下午4时。连续灌胃7次后，于末次给药后2 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，颈总动脉取血，以1.5% EDTANa2抗凝（血液︰抗凝剂=9︰1），4 ℃、3 000 r/min离心15 min取血浆。将各给药组各鼠血浆等量混合即为含药血浆，空白组各鼠血浆等量混合即为空白血浆。过滤除菌后分装，－70 ℃保存。

　　1.2.3 空白血浆对VSMC生长的影响 采用MTT法测定。VSMC培养于96孔培养板，然后以无血清DMEM培养24 h使细胞生长同步化于G0期，分别加入不同浓度空白血浆（终浓度为0%、1%、5%、10%、15%、20%、25%），每孔总体积200 μL。培养24 h后，加入MTT（5 mg/mL）20 μL，4 h后倾去培养液加入DMSO 200 μL，振荡10 min后酶标仪上检测490 nm处光密度值（optical density，OD），计算空白血浆对VSMC生长的抑制率（inhibitory rate，IR）：IR=［1－(实验组OD值/空白组OD值)］×100%。空白血浆的每个浓度在同一培养板上重复5次。取IR＜20%的血浆浓度作为对细胞正常生长无影响的浓度。

　　1.2.4 含药血浆对PDGFBB诱导的VSMC增殖的半数抑制浓度测定 采用MTT法测定各含药血浆对VSMC增殖抑制的半数抑制浓度（50% inhibitory concentration，IC50）。各含药血浆分为无血浆空白对照组，PDGFBB刺激组，终浓度分别为1%、5%、10%和15%的血浆组。VSMC培养于96孔培养板，然后用无血清培养基培养24 h使细胞生长同步化于G0期，再分别加入不同终浓度的各含药血浆。3 h后加入PDGFBB（终浓度10 ng/mL），总体积为200 μL。培养24 h后，加入MTT（5 mg/mL）20 μL，4 h后倾去培养液加入DMSO 200 μL，振荡10 min后检测490 nm处OD值。各含药血浆的每个浓度重复5次，IR＝［（PDGFBB刺激组OD值－含药血浆组OD值）/（PDGFBB刺激组OD值－无血浆空白对照组OD值）］×100%。以含药血浆浓度为自变量，IR为因变量进行logistic回归分析，求出各含药血浆抑制50% VSMC增殖的浓度（IC50）。

　　1.2.5 PDGFBB诱导的VSMC生长曲线的测定 采用MTT法。VSMC培养于96孔培养板，然后用无血清培养基培养24 h使细胞生长同步化于G0期。实验设为无血浆空白对照组、PDGFBB刺激组、空白血浆组、阿托伐他汀含药血浆组、补阳还五汤含药血浆组、生物碱含药血浆组、苷含药血浆组和TSPN含药血浆组。无血浆空白对照组每孔加入200 μL培养液。PDGFBB剌激组加入180 μL培养液，3 h后加入PDGFBB（终浓度10 ng/mL）20 μL。空白血浆组和各含药血浆组分别加入160 μL培养液、20 μL空白血浆或含药血浆（终浓度为10%，各含药血浆终浓度约为各含药血浆的IC50），3 h后加入PDGFBB 20 μL。37 ℃、5% CO2继续培养。分别于0、12、24、48 h后取出培养板，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），继续37 ℃、5% CO2孵育4 h。吸除培养板各孔液体，每孔加入200 μL DMSO并震荡10 min，测定各孔490 nm OD值，以OD值反映VSMC的增殖活性。

　　1.2.6 VSMC细胞周期的测定 将培养细胞分为无血浆空白对照组、PDGFBB刺激组、10%空白血浆组、10%阿托伐他汀含药血浆组、10%补阳还五汤含药血浆组、10%生物碱含药血浆组、10%苷含药血浆组和10% TSPN含药血浆组。用无血清培养基培养24 h使细胞同步化于G0期，然后分别加入各含药血浆，3 h后除无血浆空白对照组外各组均加入PDGFBB（终浓度10 ng/mL），培养24 h后用流式细胞分选术测定VSMC细胞周期。取约1×106个细胞/mL，用75%酒精固定后用PBS洗一遍，室温、避光下PI染色(含PI 50 μg/mL，RNase inhibitor 100 μg/mL，0.1% Triton X100)，至少30 min后上机测定，流式细胞仪（型号FACSCalibur，美国BD公司生产）上检测各细胞周期的百分率，CellQuest软件分析结果。

　　1.3 统计学方法 应用SPSS 16.0统计学软件进行分析。实验结果数据采用x±s表示。多组间均数比较用单因素方差分析，组间两两比较方差齐者用LSD法检验，方差不齐者用Dunnet’s T3法检验。检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 VSMC鉴定 倒置显微镜下，培养的VSMC贴壁生长，细胞呈长梭形，放射性生长，细胞胞质透明，相互融合在一起。成束的细胞平行排列，呈铺路石样“峰谷”状生长。可见到VSMC胞浆中α平滑肌肌动蛋白呈阳性表达，纯度达90%以上。表明培养的细胞为VSMC。

　　2.2 空白血浆对VSMC生长的影响 随着浓度的增加，空白血浆对VSMC增殖的抑制作用逐渐增强，当空白血浆浓度达20%时，其对VSMC增殖的抑制率为39.41%，表明空白血浆对VSMC生长具有一定的抑制作用。而空白血浆浓度为15%时，对VSMC增殖的抑制率为16.99%。故在实验中所用血浆的浓度不超过15%。见图1。

　　图1 空白血浆抑制VSMC生长的抑制曲线（略）

　　Figure 1 VSMC growthinhibitory curve of blank plasma

　　2.3 各含药血浆对PDGFBB诱导的VSMC增殖的IC50 各含药血浆可以显著抑制由PDGFBB诱导的VSMC增殖，随着浓度的增高，抑制作用增强，各含药血浆的IC50均为10%～15%，各含药血浆IC50比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。由此确定各含药血浆的加入浓度均取10%。见表1和图2。

　　2.4 各含药血浆对PDGFBB诱导的VSMC增殖的影响 随着培养时间的延长，各组VSMC增殖活性逐渐增强，其中以PDGFBB刺激组VSMC增殖活性最强，PDGFBB刺激组12～48 h时的增殖活性显著高于无血浆空白对照组（P＜0.05）。空白血浆组的细胞增殖活性也较强，在12～48 h时也显著高于无血浆空白对照组（P＜0.05），但其增殖活性略低于相应时间点的PDGFBB刺激组（P＜0.05），表明空白血浆对PDGFBB诱导的VSMC增殖有轻微的抑制作用。各含药血浆组VSMC增殖活性降低，在12～48 h时均显著低于空白血浆组（P＜0.05），表明各含药血浆能抑制PDGFBB诱导的VSMC增殖。各含药血浆组VSMC增殖活性在12～48 h时均高于无血浆空白对照组（P＜0.05），表明各含药血浆并不能完全抑制PDGFBB诱导的VSMC增殖。各含药血浆组VSMC增殖活性比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。表明终浓度为10%的含药血浆在24～48 h时均可抑制PDGFBB诱导的VSMC增殖。因此，确定在以下的实验中含药血浆的作用时间为24 h。见表2。

　　2.5 各含药血浆对PDGFBB诱导的VSMC增殖细胞周期的影响 PDGFBB刺激组与无血浆空白对照组比较，G0/G1期细胞数显著减少（P&<0.01），G2/M期和S期细胞数显著增多（P&<0.05）。空白血浆组与PDGFBB刺激组比较，G0/G1期细胞数增多（P&<0.05），G2/M期和S期细胞数减少（P&<0.05），表明空白血浆对细胞周期的转换具有一定的抑制作用，可在一定程度上阻抑PDGFBB诱导的VSMC由静止期进入增殖期。空白血浆组与无血浆空白对照组比较，G0/G1期细胞数显著减少（P&<0.05，G2/M期和S期细胞数显著增多（P&<0.05）。各含药血浆组与空白血浆组比较，G0/G1期细胞数显著增多（P&<0.01），G2/M期和S期细胞数显著减少（P&<0.01）。各含药血浆组与无血浆空白对照组比较，G0/G1期细胞数显著增多（P&<0.05），G2/M期和S期细胞数显著减少（P&<0.05），表明各含药血浆对PDGFBB诱导的VSMC细胞周期的转换具有显著的抑制作用，可阻抑VSMC由静止期进入增殖期。而各含药血浆组G0/G1期和G2/M期+S期细胞数比较，差异均无统计学意义（P&>0.05）。见表3。

　　表1 各含药血浆抑制PDGFBB诱导的VSMC增殖的IC50（略）

　　Table 1 IC50 of plasma containing various components on VSMC proliferation induced by PDGFBB

　　图2 各含药血浆对PDGFBB诱导的VSMC增殖的抑制曲线（略）

　　Figure 2 VSMC growthinhibitory curves of plasma containing various components induced by PDGFBB

　　A: Plasma containing alkaloids; B: Plasma containing glycosides; C: Plasma containing BYHWD; D: Plasma containing TSPN; E: Plasma containing atorvastatin.

　　表2 各含药血浆对PDGFBB诱导的VSMC增殖的影响（略）

　　Table 2 Effects of plasma containing various components on VSMC proliferation induced by PDGFBB

　　*P&<0.05， vs blank control group; △P&<0.05， vs PDGFBB stimulation group; ▲P&<0.05， vs blank plasma control group.

　　表3 各含药血浆对PDGFBB诱导的VSMC增殖细胞周期的影响（略）

　　Table 3 Effects of plasma containing various components on VSMC proliferative cycle

　　*P&<0.05， **P&<0.01， vs blank control group; △P&<0.05， vs PDGFBB stimulation group; ▲▲P&<0.01， vs blank plasma control group.

　　3 讨论

　　3.1 用含药血浆进行中药及复方体外实验的可行性 在研究药物的作用时，常采用体外实验。由于中药和复方复杂的化学成分及其代谢过程，利用中药粗提物直接加入体外实验体系进行实验，常影响实验结果的真实性和可靠性。1987年，日本学者Iwama等［8］首先报道了用动物含药血清进行体外实验的药理学方法，是一种给动物灌服中药或复方一定时间后，取其血清进行体外实验的方法。认为进入动物血液的是含有真正有效成分的“中药提取物”（包括中药的固有成分及其代谢产物，以及它们在吸收后作用于机体产生的生理活性物质）。这种方法被命名为“血清药理学（serum pharmacology）”方法，是研究中药或复方药理作用的一个实用的体外实验系统，不仅能反映中药中可吸收部分的直接作用，还能反映药物成分在体内形成的代谢产物和药物诱生的机体内源性活性物质的作用，更接近药物在体内环境下产生的真实过程，为从细胞和分子水平研究中药药理作用提供了新的手段。其后，对这种实验方法的条件进行了大量的研究，在实验对象的选择、给药剂量的确定、给药方案、采血时间、血清的处理等方面日趋规范。
　　
　　尽管血清药理学方法在中药和复方药理研究中有重要的作用，但其局限性也日益受到关注［2］。其局限性主要表现在以下几个方面。
　　
　　（1）给动物灌服中药后，被胃肠道吸收的中药成分首先进入血液，更确切地说，是进入血浆。但血浆并不等同于血清，血清是血液凝固后去除纤维蛋白与血细胞后留下的液体。在血液凝固过程中，除凝血系统激活外，同时还伴有抗凝系统、纤溶系统、抗纤溶系统、补体系统以及激肽系统发生不同程度活化，故血清不能简单地理解为去纤维蛋白的血浆。由于血液凝固的影响，可能会导致吸收入血的某些中药成分降解，或使某些本无活性的中药成分水解成有活性或毒性的成分，故含药血清中的药物成分并不一定反映的是中药进入血液中的成分。因此血清药理学方法不能视为符合中药在体内的真实过程。
　　
　　（2）凝血过程有一系列酶生成，这些酶可能降解某些中药成分，也可能使某些本无作用的原形成分经过降解而产生一定的活性。同时，在制备血清的过程中，有些成分可能与血细胞和血浆蛋白结合或吸附，在去除纤维蛋白和血细胞以及灭活血清时，必然导致部分中药成分和中药引起体内释放的某些生物活性物质损失。因此，血清药理学方法可能并不能正确反映中药的有效成分。
　　
　　（3）凝血过程中产生的凝血酶可刺激血小板与白细胞释放大量生物活性物质，所以正常血清具有明显生物活性。因此，血清药理学方法可能并不能正确排除正常血清对实验结果的影响。
　　
　　药理研究的理想方法是使用单体化合物进行实验。但在当前条件下，大多数中药及复方难以做到这一点。因此半体内实验在中药药理研究中占有重要地位。由于血清药理学方法存在一些弊病，而血浆是血液在抗凝条件下去除血细胞的液体，吸收入血的中药成分就在其中。采用HPLCMS指纹图谱分析方法，观察到含药血清丧失了大部分中药极性成分，但含药血浆却保留了大部分中药成分［2］。由于它未发生凝血反应，可以避免由此带来的对中药作用的干扰效应。因此，血浆药理学方法有可能成为中药药理研究的重要方法之一。
　　
　　本研究采用血浆药理学方法研究了补阳还五汤和其有效组分及TSPN对体外培养的VSMC增殖的影响。结果表明，空白血浆对VSMC生长和细胞周期具有轻微抑制作用。其原因可能是在制备血浆时，由于使用EDTANa2作为抗凝剂，而EDTANa2具有较强的络合Ca2+的作用，从而影响VSMC生长。这提示在制备含药血浆时，应进行抗凝剂选择的研究，以尽可能排除血浆制备过程中的各种影响。各含药血浆与空白血浆比较，均可显著抑制VSMC生长，表明采用含药血浆进行体外实验对于评价中药或复方的作用是可行的。

　　3.2 补阳还五汤和其有效组分及TSPN对VSMC增殖的影响 中膜VSMC迁移到内膜下层并异常增殖是动脉粥样硬化、冠状动脉球囊扩张术（percutaneous coronary intervention，PCI)后血管再狭窄等血管增殖性病变的共同细胞病理基础，抑制VSMC的异常迁移、增殖，阻抑血管损伤后内膜增生是治疗血管增生性疾病的关键［9］。已有的研究表明，血管紧张素受体拮抗剂、降血脂药羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂等可对抗VSMC增殖，从而延缓血管增生性病变的发生［10，11］。因而，进一步寻找可以从多环节、多靶点影响VSMC增殖的药物，具有重要的意义。中药及复方具有多成分、多效应的特点，对于复杂疾病的成因和发展可以进行多环节、多靶点的调节，这种作用特点符合VSMC异常增殖的原因和病理生理机制。研究显示［12，13］，多种植物药及有效成分具有抑制VSMC增殖的作用，对PCI后血管再狭窄可进行有效的防治。但目前中药的研究还存在制剂较粗糙、质量不稳定、作用机制不明确等缺点。因此，进一步开展中药及其有效成分抗血管再狭窄的研究，对寻找作用明确、成分相对清楚、质量可控的中药及其复方制剂，提高中医药疗效具有重要的意义。
　　
　　本研究表明，PDGFBB剌激后，VSMC增殖活性显著增强，G0/G1期细胞数减少，G2/M期和S期细胞数增多。表明在PDGFBB剌激后，VSMC细胞周期启动，细胞增殖增快。与PDGFBB剌激组比较，空白血浆可使G0/G1期细胞数增多，G2/M期和S期细胞数减少。这可能是血浆中含有的抗凝剂EDTANa2对细胞生长的影响所致。阳性对照药阿托伐他汀含药血浆可抑制PDGFBB诱导的VSMC增殖，增加G0/G1期细胞数，减少G2/M期和S期细胞数。表明阿托伐他汀对PDGFBB诱导的VSMC增殖具有抑制作用。补阳还五汤含药血浆、有效组分生物碱含药血浆、苷含药血浆和TSPN含药血浆均可抑制PDGFBB诱导的VSMC增殖，增加G0/G1期细胞数，减少G2/M期和S期细胞数。表明补阳还五汤及其有效组分生物碱和苷均可抑制PDGFBB诱导的VSMC增殖。前期研究表明，补阳还五汤及其有效组分和TSPN可抑制大鼠主动脉球囊损伤后血管内膜增生，延缓血管再狭窄的发生［4，6］，因而，抗VSMC增殖作用是补阳还五汤和TSPN延缓血管再狭窄病变的主要作用机制，生物碱和苷可能为补阳还五汤中抗VSMC增殖的主要药效物质，补阳还五汤及其有效组分生物碱和苷具有与阿托伐他汀、TSPN相似的抗VSMC增殖的作用。

参考文献

　　1 Xue J， Xie ML. Advances in methodology in serum pharmacology of Chinese materia medica. Zhong Cao Yao. 2003; 34(6): U009U011. Chinese.

　　薛洁， 谢梅林. 中药血清药理学的方法学研究近况. 中草药. 2003; 34(6): 附009附011.

　　2 He SL， Ge JW， He R， Mei ZG. Doubt the validity of serum pharmacology， emphasize the ex vivo experiments on multiple levels. Zhongguo Yao Li Xue Tong Bao. 2005; 21(3): 277279. Chinese with abstract in English.

　　贺石林， 葛金文， 贺蓉， 梅志刚. 质疑血清药理学， 加强多层次半体内实验研究. 中国药理学通报. 2005; 21(3): 277279.

　　3 Wu L， Zhang W， Li H， Zhang GM， Chen BY， Tang YH， Deng CQ. Effects of Buyang Huanwu Decoction and its alkaloids and glycosides on aortic intimal hyperplasia and expression of proliferating cell nuclear antigen in rats with aortic intimal injuries. J Chin Integr Med. 2008; 6(8): 836842. Chinese with abstract in English.

　　吴露， 张伟， 李花， 张国民， 陈北阳， 唐映红， 邓常清. 补阳还五汤及其有效组分生物碱和苷对大鼠血管内膜损伤后主动脉内膜增生和增殖细胞核抗原表达的影响. 西医结合">中西医结合学报. 2008; 6(8): 836842.

　　4 Wu L， Zhang W， Li H， Chen BY， Tang YH， He FY， Deng CQ. Inhibition of aortic intimal hyperplasia and cell cycle protein and extracellular matrix protein expressions by Buyang Huanwu Decoction. J Ethnopharmacol. 2009; 125(3): 423435.

　　5 Lin SG， Zheng XL， Chen QY， Sun JJ. Effect of Panax notoginseng saponins on increased proliferation of cultured aortic smooth muscle cells stimulated by hypercholesterolemic serum. Zhongguo Yao Li Xue Bao. 1993; 14(4): 314316.

　　6 Wu L， Zhang W， Tang YH， Li H， Chen BY， Zhang GM， Deng CQ. Effect of total saponins of “Panax notoginseng root” on aortic intimal hyperplasia and the expressions of cell cycle protein and extracellular matrix in rats. Phytomedicine. 2009 Sep 10. ［Epub ahead of print］

　　7 Ma QL， Sun M， Yang TL， Li YJ， Tang CE， Peng ZY， He SL， Chen FP. Effects of Tongxinluo on cell viability and tissue factor in Ang Ⅱ induced vascular endothelial cells. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2007; 32(3): 485488. Chinese with abstract in English.

　　马琦琳， 孙明， 杨天山仑， 李元建， 汤参娥， 彭振宇， 贺石林， 陈方平. 通心络对血管紧张素Ⅱ诱导的血管内皮细胞活力及组织因子的影响. 中南大学学报(医学版). 2007; 32(3): 485488.

　　8 Iwama H， Amagaya S， Ogihara Y. Effect of shosaikoto， a Japanese and Chinese traditional herbal medicinal mixture， on the mitogenic activity of lipopolysaccharide: a new pharmacological testing method. J Ethnopharmacol. 1987; 21(1): 4553.

　　9 Kim MJ， Park KG， Lee KM， Kim HS， Kim SY， Kim CS， Lee SL， Chang YC， Park JY， Lee KU， Lee IK. Cilostazol inhibits vascular smooth muscle cell growth by downregulation of the transcription factor E2F. Hypertension. 2005; 45(4): 552556.

　　10 Peters S， Gtting B， Trümmel M， Rust H， Brattstrm A. Valsartan for prevention of restenosis after stenting of type B2/C lesions: the VALPREST trial. J Invasive Cardiol. 2001; 13(2): 9397.

　　11 Walter DH， Schchinger V， Elsner M， Mach S， AuchSchwelk W， Zeiher AM. Effect of statin therapy on restenosis after coronary stent implantation. Am J Cardiol. 2000; 85(8): 962968.

　　12 Pan SL， Huang YW， Guh JH， Chang YL， Peng CY， Teng CM. Esculetin inhibits Rasmediated cell proliferation and attenuates vascular restenosis following angioplasty in rats. Biochem Pharmacol. 2003; 65(11): 18971905.

　　13 Kim DW， Park YS， Kim YG， Piao H， Kwon JS， Hwang KK， Youn TJ， Park JB， Yun YP， Sachinidis A， Kim CH， Cho MC， Ahn HY. Local delivery of green tea catechins inhibits neointimal formation in the rat carotid artery injury model. Heart Vessels. 2004; 19(5): 242247.